Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
البكتيريا ترميز آليات متنوعة للانخراط في المنافسة بين البكتيريا. هنا، نقدم بروتوكولاً قائماً على الثقافة لتوصيف التفاعلات التنافسية بين العزلات البكتيرية وكيفية تأثيرها على البنية المكانية للسكان المختلطين.
تصف هذه المخطوطة اختبارًا قائمًا على الثقافة وتكعيباً للكشف عن التفاعلات التنافسية بين اثنين من التجمعات البكتيرية ووصفها. وتستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تسمح لكل مجموعة من السكان بأن تكون الموسومة بشكل مختلف بقدرات مقاومة المضادات الحيوية المتميزة والبروتينات الفلورية للاختيار والتمييز البصري لكل شعب، على التوالي. هنا، نقوم بوصف إعداد وتكتكع سلالات Vibrio fischeri المتنافسة، والتصوير المجهري الفلوري، وتحليل البيانات الكمية. وهذا النهج بسيط، ويسفر عن نتائج سريعة، ويمكن استخدامه لتحديد ما إذا كان أحد السكان يقتل أو يعوق نمو سكان آخرين، وما إذا كانت المنافسة تتوسط من خلال جزيء غير قابل للاستخدام أو تتطلب الاتصال المباشر بالخلايا الخلوية. ولأن كل مجموعة بكتيرية تعبر عن بروتين فلورسنت مختلف، فإن هذا التحليل يسمح بالتمييز المكاني للسكان المتنافسين داخل مستعمرة مختلطة. على الرغم من أن يتم تنفيذ الأساليب الموصوفة مع البكتيريا التكافلية V. fischeri باستخدام الظروف الأمثل لهذا النوع، يمكن تكييف البروتوكول لمعظم العزلات البكتيرية القابلة للزراعة.
تحدد هذه المخطوطة طريقة قائمة على الثقافة لتحديد ما إذا كان عزلتان بكتيريتان قادرتين على التفاعل التنافسي. عند دراسة السكان المختلطين، من المهم تقييم مدى تفاعل العزلات البكتيرية، لا سيما ما إذا كانت المعزولات تتنافس مباشرة من خلال آليات التداخل. تشير المنافسة على التداخل إلى التفاعلات التي يمنع فيها أحد السكان بشكل مباشر النمو أو يقتل السكان المنافسين1. هذه التفاعلات مهمة لتحديد لأنها يمكن أن يكون لها آثار عميقةعلى بنية المجتمع الميكروبي ووظيفته 2،3.
وقد تم اكتشاف آليات للمنافسة الميكروبية على نطاق واسع في جينومات البكتيريا من بيئات متنوعة بما في ذلك كل من ال....
1. إعداد سلالات لCoincubation
من أجل تقييم التفاعلات التنافسية بين السكان البكتيرية، تم وضع بروتوكول فحص coincubation والأمثل لV. fischeri. تستخدم هذه الطريقة بلازميدات مستقرة تقوم بترميز جينات مقاومة المضادات الحيوية والبروتينات الفلورية، مما يسمح بالاختيار التفاضلي والتمييز البصري لكل سلالة. من خلال ?.......
يوفر تصنيف التكعيبات الموضحة أعلاه طريقة قوية لاكتشاف المنافسة بين البكتيريا. وسمح هذا النهج بتحديد المنافسة الداخلية بين V. fischeri isolates وتوصيف الآلية التنافسية19. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة تم تحسينها للبكتيريا البحرية V. fischeri، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
10 μL multichannel pipette | |||
100 μL multichannel pipette | |||
300 μL multichannel pipette | |||
10 μL single channel pipette | |||
20 μL single channel pipette | |||
200 μL single channel pipette | |||
1000 μL single channel pipette | |||
24-well plates | Fisher | 07-200-84 | sterile with lid |
96-well plates | VWR | 10062-900 | sterile with lid |
Calculator | |||
Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software | |||
forceps | Fisher | 08-880 | |
Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS) | Fisher | SA1J788H5 | 0.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100) |
petri plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
Spectrophotometer | |||
Semi-micro cuvettes | VWR | 97000-586 | |
TipOne 0.1-10 μL starter system | USA Scientific | 1111-3500 | 10 racks |
TipOne 200 μL starter system | USA Scientific | 1111-500 | 10 racks |
TipOne 1000 μL starter system | USA Scientific | 1111-2520 | 10 racks |
Vortex | |||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
LBS media | |||
1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
DI water | 950 mL | ||
Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved