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Immunology and Infection

비브리오 피셔리 분리 사이의 경쟁 적 상호 작용을 정량화하기위한 동전 분석

Published: July 22nd, 2019

DOI:

10.3791/59759

1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

박테리아는 박테리아 간 경쟁에 종사하기 위한 다양한 메커니즘을 인코딩합니다. 여기에서는 박테리아 분리체와 박테리아 분리물의 공간 구조에 미치는 영향을 특성화하기 위한 문화 기반 프로토콜을 제시합니다.

이 원고는 두 박테리아 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 감지하고 특성화하기 위한 배양 기반의 동전 분석기를 설명합니다. 이 방법은 각 인구의 선택과 시각적 인 차별을 위해 각 인구가 뚜렷한 항생제 내성 기능 및 형광 단백질로 차별적으로 태그 될 수 있도록 안정적인 플라스미드를 사용합니다. 여기에서는, 우리는 경쟁하는 Vibrio fischeri 긴장, 형광 현미경 화상 진찰 및 정량적인 데이터 분석의 준비 그리고 동전을 기술합니다. 이 접근법은 간단하고, 빠른 결과를 산출하고, 한 집단이 다른 집단의 성장을 죽이거나 억제하는지, 그리고 경쟁이 확산 가능한 분자를 통해 매개되는지 또는 직접적인 세포 세포 접촉을 필요로 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 각 세균성 인구는 다른 형광 성 단백질을 표현하기 때문에, 분석은 혼합 된 식민지 내에서 경쟁 인구의 공간 차별을 허용합니다. 기재된 방법은 이 종에 최적화된 조건을 사용하여 공생 균 V. fischeri로 수행되지만, 프로토콜은 대부분의 균류균 분리에 적응될 수 있다.

이 원고는 두 개의 세균 성 분리가 경쟁적인 상호 작용을 할 수 있는지 여부를 결정하는 문화 기반 방법을 간략하게 설명합니다. 혼합 인구를 연구할 때, 박테리아 격리가 상호 작용하는 정도, 특히 격리가 간섭 메커니즘을 통해 직접 경쟁하고 있는지 여부를 평가하는 것이 중요합니다. 간섭 경쟁은 한 집단이 직접 성장을 억제하거나 경쟁집단을 죽이는 상호 작용을 말합니다 1. 이러한 상호 작용은 미생물 커뮤니티의 구조 및 기능2,3에심오한 영향을 미칠 수 있기 때문에 식별하는 것이 중요합니다.

미생물 경쟁을 위한 기계장치는 호스트 관련및 자유로운 생활 박테리아를포함하여 다양한 환경에서 박테리아의 게놈에서 광범위하게 발견되었습니다 4,5,6,7, 8,9. ....

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1. 동전 큐브에 대한 균주를 준비

  1. 동전 분석 동안 세균 경쟁의 표적으로 작용할 적절한 기준 균주를 선택한다. 참조 변형률을 선택할 때의 모범 사례와 참조 변형이 결과에 미치는 영향에 대한 토론을 참조하십시오. 이 프로토콜에서, V. fischeri 스트레인 ES114는 기준 균주로서 작용할 것이다.
  2. 코인큐베이션에서 분리된 분리를 구별하기 위해 어떤 선택 및 스?.......

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세균 집단 간의 경쟁적인 상호 작용을 평가하기 위해, 동전 분석 프로토콜이 개발되고 V. fischeri에최적화되었다. 이 방법은 항생 저항 유전자 및 형광 성 단백질을 인코딩하는 안정한 플라스미드를 활용하여 각 균주의 차등 선택 및 시각적 차별을 허용합니다. 동전 분석에서 수집된 데이터를 분석함으로써, 상호작용의 경쟁적 결과 및 상호작용의 메커니즘을 식별할 .......

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전술한 코인큐브레이션 분석법은 박테리아 간 경쟁을 발견할 수 있는 강력한 방법을 제공한다. 이러한 접근법은 V. fischeri 격리 및 경쟁 메커니즘의 특성화 사이의 특정 경쟁의 식별을허용19. 기재된 방법은 해양 균 V. fischeri에최적화되었지만 임상 및 환경 분리를 포함한 다른 세균 종을 수용하기 위해 용이하게 변형될 수 있다. 경쟁 메커니즘은 종종 조건부 5, 6

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우리는 그들의 유용한 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. A.N.S.는 그랜트 GBMF 255.03을 통해 고든과 베티 무어 재단의 지원을 받아 생명과학 연구 재단에 지원되었습니다.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well platesFisher07-200-84sterile with lid
96-well platesVWR10062-900sterile with lid
Calculator
ChloramphenicolSigmaC0378stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forcepsFisher08-880
Kanamycin SulfateFisherBP906-5stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri platesFisherFB0875713sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettesVWR97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter systemUSA Scientific1111-350010 racks
TipOne 200 μL starter systemUSA Scientific1111-50010 racks
TipOne 1000 μL starter systemUSA Scientific1111-252010 racks
Vortex
NameCompanyCatalog NumberComments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5)50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Add only for plates)
DI water950 mL
Sodium ChlorideFisherS640-320 g
TryptoneFisherBP9726510 g
Yeast ExtractFisherBP9727-25 g

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