JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Immunology and Infection

Vibrio fischeri Izolatlar arasında rekabetçi etkileşimleri ölçmek için kokuluçak assay

Published: July 22nd, 2019

DOI:

10.3791/59759

1Department of Marine Sciences, University of North Carolina, Chapel Hill

Bakteriler, interbakteriyel rekabetle uğraşmak için farklı mekanizmalar kodlayabilir. Burada, bakteriyel izolatlar ve karma bir nüfusun uzamsal yapısını nasıl etkilediğini arasında rekabetçi etkileşimleri karakterize etmek için kültür tabanlı bir protokol sunuyoruz.

Bu yazıda iki bakteriyel nüfus arasındaki rekabet etkileşimlerini algılamak ve karakterize etmek için kültür tabanlı, kokuluçlama tahlili açıklanmaktadır. Bu yöntem, her nüfusun, sırasıyla her nüfusun seçim ve görsel ayrımcılığı için farklı antibiyotik direnci yetenekleri ve floresan proteinleri ile ayırt edilmesini sağlayan istikrarlı plazmids kullanır. Burada, rakip Vibrio fischeri suşları, floresans mikroskopisi görüntüleme ve nicel veri analizinin hazırlanması ve kokulerasyonu açıklanmaktadır. Bu yaklaşım basittir, hızlı sonuçlar verir ve bir nüfus öldürür veya başka bir nüfusun büyümesini inhibe olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir, ve rekabet bir differe molekül yoluyla aracılık veya doğrudan hücre hücresi temas gerektirir. Her bakteriyel nüfus farklı bir floresan protein ifade ettiği için, tahlil karma bir koloni içinde rakip nüfusun uzamsal ayrımcılık izin verir. Açıklanan yöntemler bu tür için optimize koşulları kullanarak simbiyotik bakteri V. fischeri ile gerçekleştirilir rağmen, protokol en culturable bakteriyel izolatlar için adapte edilebilir.

Bu yazıda iki bakteriyel yalıtın rekabetçi etkileşimlere sahip olup olmadığını belirlemek için kültür tabanlı bir yöntem özetlenmiştir. Karışık nüfus okurken, özellikle izolatlar doğrudan girişim mekanizmaları ile rekabet olup olmadığını, bakteriyel yalıtılmaların etkileşim ölçüde değerlendirmek önemlidir. Girişim Yarışması, bir nüfusun doğrudan büyüme inhibe veya bir rakip nüfus öldürür etkileşimleri anlamına gelir1. Bu etkileşimlerin bir mikrobiyal topluluğun yapısı ve işlevi2,3üzerinde derin etkileri olabilir çünkü tanımlamak için önemlidir.

Mikrobiyal yar....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Kokuleleme için suşları hazırlayın

  1. Kokuluzasyon tahlil sırasında bakteriyel rekabet için hedef olarak hizmet edecek uygun bir referans gerinim seçin. Başvuru gerinim seçerken en iyi uygulamalar için tartışma konusuna ve referans gerinimin sonuçları nasıl etkilediğini görün. Bu protokolde, V. fischeri strain ES114 referans gerinim olarak hizmet verecektir.
  2. Kokulinasyon içinde yalıtlar arasında ayrım yapmak için hangi seçim ve tarama yönte.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bakteriyel nüfus arasında rekabetçi etkileşimleri değerlendirmek için, bir kokulerasyon tahlil Protokolü geliştirilmiştir ve V. fischeriiçin optimize edilmiştir. Bu yöntem, antibiyotik direnci genler ve floresan proteinleri kodlayan istikrarlı plazmids kullanır, diferansiyel seçimi ve her gerinin görsel ayrımcılık için izin. Coinkübasyon testinden toplanan verileri analiz ederek, bir etkileşimin rekabetçi sonucu ve etkileşimin mekanizması tespit edilebili.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yukarıda açıklanan kokuluzasyon tahlil interbakteriyel rekabet keşfetmek için güçlü bir yöntem sağlar. Bu yaklaşım, V. fischeri izolatlar ve rekabetçi mekanizma19karakterizasyonu arasında intraspecific rekabetin tanımlanması için izin. Tanımlanan yöntem Marine bakteri V. fischeriiçin optimize edilmiştir rağmen, kolayca klinik ve çevresel izolatlar dahil olmak üzere diğer bakteriyel türler yerleştirmek için değiştirilebilir. Rekabetçi mekanizmaların.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Biz onların yararlı geribildirim için yorumcular teşekkür etmek istiyorum. A.N.S., Gordon ve Betty Moore Vakfı tarafından Grant GBMF 255,03 aracılığıyla Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı 'na destekleniyordu.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL Microcentrifuge TubesFisher05-408-129
10 μL multichannel pipette
100 μL multichannel pipette
300 μL multichannel pipette
10 μL single channel pipette
20 μL single channel pipette
200 μL single channel pipette
1000 μL single channel pipette
24-well platesFisher07-200-84sterile with lid
96-well platesVWR10062-900sterile with lid
Calculator
ChloramphenicolSigmaC0378stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS)
Fluorescence dissecting microscope with camera and imaging software
forcepsFisher08-880
Kanamycin SulfateFisherBP906-5stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS)
Nitrocellulose membrane (FS MCE, 25MM, NS)FisherSA1J788H50.22 μm nitrocellulose membrane (pk of 100)
petri platesFisherFB0875713sterile with lid
Spectrophotometer
Semi-micro cuvettesVWR97000-586
TipOne 0.1-10 μL starter systemUSA Scientific1111-350010 racks
TipOne 200 μL starter systemUSA Scientific1111-50010 racks
TipOne 1000 μL starter systemUSA Scientific1111-252010 racks
Vortex
NameCompanyCatalog NumberComments
LBS media
1M Tris Buffer (pH ~7.5)50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base)
Agar TechnicalFisherDF0812-17-915 g (Add only for plates)
DI water950 mL
Sodium ChlorideFisherS640-320 g
TryptoneFisherBP9726510 g
Yeast ExtractFisherBP9727-25 g

  1. Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
  2. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 2 (8), 632-642 (2004).
  3. Dörr, N. C. D., Blockesh, M. Bacterial type VI secretion system facilitates niche domination. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), 8855-8857 (2018).
  4. Maclntyre, D. L., Miyata, S. T., Kitaoka, M., Pukatzki, S. The Vibrio cholerae type VI secretion system displays antimicrobial properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (45), 19520-19524 (2010).
  5. Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), e61086 (2013).
  6. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  7. Schwarz, S., et al. Burkholderia type VI secretion systems have distinct roles in eukaryotic and bacterial cell interactions. PLoS Pathogens. 6 (8), e1001068 (2010).
  8. Wenren, L. M., Sullivan, N. L., Cardarelli, L., Septer, A. N., Gibbs, K. A. Two independent pathways for self-recognition in Proteus mirabilis are linked by type VI-dependent export. MBio. 4 (4), (2013).
  9. García-Bayona, L., Guo, M. S., Laub, M. T. J. E. Contact-dependent killing by Caulobacter crescentus via cell surface-associated, glycine zipper proteins. Elife. 6, 24869 (2017).
  10. Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
  11. Cornforth, D. M., Foster, K. R. Antibiotics and the art of bacterial war. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (35), 10827-10828 (2015).
  12. Shank, E. A., Kolter, R. New developments in microbial interspecies signaling. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 205-214 (2009).
  13. Roelofs, K. G., Coyne, M. J., Gentyala, R. R., Chatzidaki-Livanis, M., Comstock, L. E. Bacteroidales secreted antimicrobial proteins target surface molecules necessary for gut colonization and mediate competition in vivo. MBio. 7 (4), e01055-e01016 (2016).
  14. Dey, A., Vassallo, C. N., Conklin, A. C., Pathak, D. T., Troselj, V., Wall, D. Sibling rivalry in Myxococcus xanthus is mediated by kin recognition and a polyploid prophage. Journal of bacteriology. 198 (6), (2016).
  15. Danka, E. S., Garcia, E. C., Cotter, P. A. Are CDI systems multicolored, facultative, helping greenbeards?. Trends in Microbiology. 25 (5), 391-401 (2017).
  16. Willett, J. L., Ruhe, Z. C., Coulding, C. W., Low, D. A., Hayes, C. S. Contact-dependent growth inhibition (CDI) and CdiB/CdiA two-partner secretion proteins. Journal of molecular biology. 427 (23), 3754-3765 (2015).
  17. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends in Microbiology. 24 (1), 51-62 (2016).
  18. Joshi, A., Kostiuk, B., Rogers, A., Teschler, J., Pukatzki, S., Yildiz, F. H. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
  19. Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8528-E8537 (2018).
  20. Shank, E. A. Using coculture to detect chemically mediated interspecies interactions. Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).
  21. Long, R. A., Rowley, D. C., Zamora, E., Liu, J., Bartlett, D. H., Azam, F. Antagonistic interactions among marine bacteria impede the proliferation of Vibrio cholerae. Applied and Environmental Microbiology. 71 (12), 8531-8536 (2005).
  22. Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
  23. Sana, T. G., et al. The second type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa strain PAO1 is regulated by quorum sensing and Fur and modulates internalization in epithelial cells. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 27095-27105 (2012).
  24. Bachmann, V., Kostiuk, B., Unterweger, D., Diaz-Satizabal, L., Ogg, S., Pukatzki, S. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS. 9 (8), e0004031 (2015).
  25. Ishikawa, T., Rompikuntal, P. K., Lindmark, B., Milton, D. L., Wai, S. N. Quorum sensing regulation of the two hcp alleles in Vibrio cholerae O1 strains. PloS One. 4 (8), e6734 (2009).
  26. Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
  27. Pollack-Berti, A., Wollenberg, M. S., Ruby, E. G. Natural transformation of Vibrio fischeri requires tfoX and tfoY. Environmental Microbiology. 12 (8), 2302-2311 (2010).
  28. Meibom, K. L., Blockesh, M., Dolganov, N. A., Wu, C. Y., Schoolnik, G. K. Chitin induces natural competence in Vibrio cholerae. Science. 310 (5755), 1824-1827 (2005).
  29. Borgeaud, S., Metzger, L. C., Scrignari, T., Blockesh, M. The type VI secretion system of Vibrio cholerae fosters horizontal gene transfer. Science. 347 (6217), 63-67 (2015).
  30. Townsley, L., Mangus, M. P. S., Mehic, S., Yildiz, F. H. Response of Vibrio cholerae to low-temperature shift: CpsV regulates type VI secretion, biofilm formation, and association with zooplankton. Applied and Environmental Microbiology. 82 (14), 00807-00816 (2016).
  31. Huang, Y., et al. Functional characterization and conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio fluvialis. Frontiers in microbiology. 8, 528 (2017).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved