使用微注射在人赫拉细胞中分体血球定位分析

摘要

乘腔snRNA的生物发生是一个复杂的过程,涉及各种细胞隔间。在这里,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,以监测其在细胞内的传输。

摘要

乘子鼻核素的生物发生是一个复杂的过程,涉及核和细胞质阶段,最后一步发生在一个称为Cajal体的核隔间中。然而,将snRNA定位到这种亚核结构的序列直到最近才被发现。为了确定在Cajal体内积累snRNA的重要序列,我们采用荧光标记snRNA的显微注射,然后在其细胞内进行定位。首先,我们准备了snRNA缺失突变体,合成DNA模板进行体外转录,并在UTP与Alexa488相伴的情况下转录snRNA。标记snRNA与70kDa-Dextran与TRITC结合,并微注入到人类HeLa细胞的细胞质。细胞孵育1小时,固定,Cajal身体标记线圈通过间接免疫荧光可视化,而作为核或细胞质注射标志物的snRNA和dextran直接使用荧光显微镜观察。这种方法可以高效、快速地测试各种序列如何影响细胞内的RNA定位。在这里,我们展示 Sm 绑定序列对于将 snRNA 有效定位到 Cajal 体中的重要性。

引言

RNA拼接是基因表达的关键步骤之一,基因表达是由一种称为拼接体的大型核糖核蛋白复合物催化的。总共,超过150种蛋白质和5种小核RNA(snRNA)在拼接途径的不同阶段被集成到拼接体中。U1、U2、U4、U5和U6 snRNA正在参与主要GU-AG的拼接。这些snRNA加入拼接的拼接体作为预形成的小核核核核核核核核核核核核蛋白颗粒(snRNA),含有snRNA,7个Sm蛋白与snRNA(或类似Sm蛋白,与U6 snRNA相关)和1-12个特定蛋白质为每个snRNP。

snRNP 的组装涉及细胞质和核阶段。新转录的snRNA被导出到细胞质中,在那里它获得一个从七种Sm蛋白组装而成的环。Sm环随后充当snRNA重新导入到核的信号。有缺陷的snRNA,不能与Sm蛋白关联,被保留在细胞质1。新进口的snRNPs首先出现在Cajal体内,它们与snRNP特异性蛋白质相遇并完成其成熟(参考^{文献2,3)。}我们最近表明,抑制最终成熟步骤导致在Cajal身体4,5中固存未成熟的snRNPs。我们提出了一个模型,其中最终的snRNP成熟是在质量控制下,监测snRNP特异性蛋白质的添加和活性snRNPs的形成。然而,细胞....

研究方案

1. 制备用于显微注射的snRNA

1. 使用以下 PCR 设置,准备包含全长或截断/突变版本的 SnRNA 的 DNA 模板:98 °C,60 s,98 °C,15 s,68 °C,1 分钟,98 °C 15 秒和 72 °C 5 分钟。
2. 前引物必须包含一个促进因子序列,用于第一个转录核苷酸的上游体外转录。使用含有T7启动子和反向底漆的正向底漆放大U2 snRNA序列,该底漆以最后一个转录的核苷酸结束(详情见材料表)。
3. 使用用于短RNA合成试剂盒(详情见材料表)的含有T7RNA聚合酶的snRNA合成。添加 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, 0.8 mM UTP, 0.2m UTP-Alexa488, 1.8 mM 三甲基苯丙胺帽模拟 (m3^2,2,7G(5') ppp(5')G, 1 mL RNA抑制剂和 500-700 ng 的 DNA 模板到反应混合物和孵育在 37 °C 过夜.
4. 在反应中加入1μL(2U)的DNase,并在37°C下孵育15分钟。
5. 通过酸性苯酚/氯仿提取分离snRNA。去除顶部水相,加入3M醋酸钠(pH = 5.2)、3 μL糖原原体积的1/10,以更好的颗粒可视化和2.5体积的100%乙醇。在-80°C下孵育1小时,在14,000 x g和4°C下离心10分钟。

结果

为了监测snRNA的定位和Sm结合位点在Cajal身体靶向中的作用,我们准备了一个DNA模板,其中包含T7启动子和全长U2 snRNA或U2 snRNA,缺少构成Sm结合位点的七个核苷酸(AUUUUG)。snRNA在体外转录、分离和与TRITC耦合dextran-70kDa混合。我们微注射含有体外转录的snRNA的混合物到HeLa细胞的细胞质。

此前已经表明,Sm绑定场址是核^进口6所必需的。为了测试Sm位点是否对Cajal身体积累也很重要,我.......

讨论

我们采用荧光标记snRNA的显微注射来确定对snRNA定位到核Cajal体中的重要序列。由于标签RNA的快速且相当简单制备(通过PCR制备DNA模板,然后进行体外转录),该方法提供了有效分析各种序列如何促进RNA定位。在相对较短的时间内,我们能够分析U2 snRNA的10个不同的删除或替换(参考文献5和未显示的数据)。对于具有复杂生物成因途径的RNA,这种方法还允许对成熟至关重要的测试序列。在snRNA?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ChromaTide Alexa fluor 488-5-UTP	ThermoFisher	C11403	Stock concentration 1 mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium - high glucose	Sigma-Aldrich	D5796	Containing 4.5 g⁄L D-glucose, Phenol red and antibiotics
FemtoJet express Injector	Eppendorf	5247000013
Femtotips II	Eppendorf	930000043	Microinjection needle of 0.5 µm inner and 0.7 µm outer diameter
Fluoromont G with DAPI	SouthernBiotech	0100-20
Glycogen	ThermoFisher	AM9510	Stock concentration 5 mg/mL
Gridded Glass Coverslips	Ibidi	10817	Coverslips with a grid, no direct experience with them
InjectMan NI 2 Micromanipulator	Eppendorf	5181000017
m3-2,2,7G(5')ppp(5')G trimethyled cap analogue	Jena Bioscience	NU-853-1	Stock concentration 40 mM
MEGAshortscript T7 Transcription Kit	ThermoFisher	AM1354
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1	Paul Marienfeld GmbH	111520	For routine work
Microscope Cover Glasses 12 mm, No. 1.5	Paul Marienfeld GmbH	117520	For high resolution images
Microscope DeltaVision	GE Healthcare		For image acquisition
Microscope DMI6000	Leica		For microinjection
Paraformaldehyde 32% solution EM grade	EMS	15714	Dissolved in PIPES to the final concentration 4%
Phenol:Chloroform 5:1	Sigma-Aldrich	P1944
Primers for U2 amplification: Forward: 5’-TAATACGACTCACTATAGGGATCGCTTCTCGGCCTTTTGG, Reverse: 5´ TGGTGCACCGTTCCTGGAGGT	Sigma-Aldrich		T7 rpromoter sequence in italics
Phusion High Fidelity DNA polymerase	BioLab	M0530L
RNasin Plus	Promega	N2615	Stock concentration 40 mM
Tetramethylrhodamine isothiocyanate Dextran 65-85 kDa	Sigma-Aldrich	T1162	Dissolved in water, stock concentration 1 mg/mL
Triton-X100	Serva	37240	Dissolved in water, stock concentration 10%