Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Parasponia andersonii er et hurtigtvoksende tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og kan danne kvælstofbindende rodknuder i forbindelse med Rhizobium. Her beskriver vi en detaljeret protokol for omvendte genetiske analyser i P. andersonii baseret på Agrobacterium tumefaciens-mediated stabil transformation og crispr/Cas9-baseret genomredigering.

Abstract

Parasponia andersonii er et hurtigtvoksende tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae). Sammen med 4 yderligere arter, det danner den eneste kendte ikke-bælg sig afstamning i stand til at etablere en kvælstof-fastsættelse knude symbiose med Rhizobium. Sammenlignende undersøgelser mellem bælgplanter og P. andersonii kunne give værdifuld indsigt i de genetiske netværk underliggende rod knudedannelse. For at lette sammenlignende undersøgelser, vi for nylig sekvenseret P. andersonii genom og etablerede Agrobacterium tumefaciens-mediated stabil transformation og crispr/Cas9-baserede genomredigering. Her giver vi en detaljeret beskrivelse af transformations-og genomredigeringsprocedurerne, der er udviklet til P. andersonii. Derudover beskriver vi procedurer for frøspire evne og karakterisering af symbiotiske fænotyper. Ved hjælp af denne protokol kan stabile transgene mutant linjer genereres i en periode på 2-3 måneder. Vegetativ in vitro-formering af T0 transgene linjer gør det muligt at initiere fænotypebestemmelse-eksperimenter 4 måneder efter Co-dyrkning af en. tumefaciens . Derfor, denne protokol tager kun marginalt længere end den forbigående Agrobacterium rhizogenes-baserede root transformation metode til rådighed for P. andersonii, men tilbyder flere klare fordele. Sammen, de procedurer, der er beskrevet her tillader P. andersonii at blive brugt som en forskningsmodel for undersøgelser med henblik på at forstå symbiotiske foreninger samt potentielt andre aspekter af biologi af dette tropiske træ.

Introduction

Parasponia andersonii er et tropisk træ, der tilhører cannabis familien (Cannabaceae) og er hjemmehørende i Papua Ny Guinea og flere Stillehavs øer1,2,3. Sammen med 4 yderligere parasponia arter, det repræsenterer den eneste ikke-bælgfrugter afstamning, der kan etablere en nitrogen-Fixing knude symbiose med rhizobia. Denne symbiose er godt undersøgt i bælgplanter (Fabaceae) modeller Medicago truncatula og Lotus japonicus, hvilket har resulteret i at erhverve detaljeret viden om den molekylære genetiske karakter af knudedannelse og fungerende4. Desuden, det blev påvist, at roden knude symbiose i bælgplanter er baseret på den meget ældre, og udbredt arbuskulær mykorrhizal symbiose5. Phylogenomic sammenligninger tyder på, at kvælstof-fastsættelse knude symbioser af bælgfrugter, parasponia, samt, de såkaldte actinorhizal plantearter, der er vært diazotrofe Frankia bakterier, har en fælles evolutionær oprindelse 6,7,8. For at afgøre, om de gener, der identificeres for at være involveret i dannelsen af bælgplanter, er den del af et bevaret genetisk grundlag, er undersøgelser af ikke-bælgplanter afgørende. Til dette formål foreslår vi at bruge P. andersonii som en komparativ forskningsmodel, sammen med bælgplanter, for at identificere de centrale genetiske netværk underliggende rod knuder dannelse og funktion.

P. andersonii er en pioner, der kan findes på skråningerne af vulkanske bakker. Det kan opfylde væksthastigheder på 45 cm pr. måned og nå længder på op til 10 meter9. P. andersonii træer er vind-Bestøvlede, som lettes ved dannelsen af separate mandlige og kvindelige blomster3,10. Vi har for nylig sekvenseret og kommenteret diploide genom (2n = 20; 560 MB/1C) af P. andersonii, og samlet udkast genom sekvenser af 2 yderligere parasponia arter; P. Rigida og p. af6. Dette afslørede ~ 35.000 P. andersonii gene modeller, der kan grupperes i > 20000 ortogrupper sammen med gener fra M. truncatula, sojabønner (Glycine max), Arabidopsis thaliana, Skovjordbær ( Af Fragaria vesca), trema orientalis, sort bomulds poppel (Populus Balsampoppel) og eucalypt (Eucalyptus Grandis)6. Derudover identificerede transkriptomsammenligninger mellem M. truncatula og P. andersonii et sæt 290 formodede orthologues, der viser et nodule-forstærket udtryks mønster i begge arter6. Dette giver en glimrende ressource til sammenlignende undersøgelser.

For at studere genet funktion i P. andersonii rødder og knuder, en protokol for Agrobacterium rhizogenes-medieret root transformation er blevet etableret11. Ved hjælp af denne protokol, sammensatte planter, der bærer transgene rødder kan genereres i en relativt kort tidsramme. Denne metode anvendes også i vid udstrækning i bælgfrugter-Symbiosis forskning12,13,14. Ulempen ved denne metode er imidlertid, at kun rødder omdannes, og at hver transgene rod repræsenterer en uafhængig transformationsbegivenhed, hvilket resulterer i betydelige variationer. Omdannelsen er også forbigående, og transgene linjer kan ikke opretholdes. Dette gør en. rhizogenes-baserede root transformation mindre VELEGNET til crispr/Cas9-mediated genomredigering. Desuden, A. rhizogenes overfører sin root inducerende locus (ROL) gener til planten genom, som engang udtrykte interferere med hormon homøostase15. Dette gør at studere rollen som plante hormoner i en. rhizogenes-forvandlet rødder udfordrende. For at overvinde disse begrænsninger, har vi for nylig udviklet en protokol for Agrobacterium tumefaciens-baseret transformation og Crispr/Cas9-medieret mutagenese af P. andersonii10.

Her giver vi en detaljeret beskrivelse af den a. tumefaciens-baserede Transformations procedure og reverse Genetics pipeline udviklet til P. andersonii. Derudover tilbyder vi protokoller for downstream håndtering af transgene plantlets, herunder analyser til at studere symbiotiske interaktioner. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, kan der genereres flere transgene linjer i en 2-3 måneders periode. I kombination med CRISPR/Cas9-medieret mutagenese, dette giver en effektiv generation af knockout mutant linjer. Disse mutante linjer kan være vegetativt formeret in vitro10,16,17, hvilket gør det muligt at fremføre tilstrækkeligt materiale til at starte fænotypisk karakterisering 4 måneder efter, at Transformations proceduren har påbegyndt10. Sammen, dette sæt af procedurer bør tillade enhver Lab til at vedtage P. andersonii som en forskningsmodel for undersøgelser med henblik på at forstå rhizobial og mykorrhizasvampene foreninger, samt potentielt andre aspekter af biologi af dette tropiske træ.

Protocol

1. Grow P. andersonii træer i drivhuset

  1. Gerubestemt P. andersonii WU1 Seeds18.
    1. Brug friske Parasponia bær eller sug tørrede bær i vand i 2 timer for at rehydrere. Squash bær på et stykke silkepapir eller gnid mod indersiden af en te sigte for at fjerne frøene.
    2. Desinficer frø ved hjælp af kommerciel blegemiddel (~ 4% hypochlorit) i 15-20 min og efterfølgende vaske frøene 6 gange ved hjælp af steriliseret vand.
    3. Overfør frøene til sterile 200 μL PCR-rør. Fyld rørene med steriliseret vand, således at frøene er helt nedsænket. Inkubér rørene i 10 dage i en termo cycler, der kører følgende program: 30 cyklusser (7 °C i 4 timer, 28 °C i 4 timer). Brug ikke et opvarmet låg, da dette kan dræbe frøene.
    4. Forbered SH-0-pladerne (Se tabel 1). Overfør frøene til SH-0 plader og Inkubér ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat. Luk pladerne med 2 lag elastisk tætnings folie for at undgå tørring under inkubationen ved 28 °C.
  2. Efter frøplanter har udviklet deres første sæt af sande blade (~ 3-4 uger efter inkubation ved 28 °C), Overfør frøplanter til Potter fyldt med kommerciel pottejord og dække frøplanterne med en gennemsigtig plastik kop for at forhindre udtørring. Placer Potter i en 28 °C klima værelse eller drivhus, ~ 85% RH, under en 16 h:8 h dag: Night regime.
  3. Efter 1 uge fjernes det gennemsigtige plastikbæger. Vand Potter regelmæssigt, og når træerne vokser større supplement med gødning til at opretholde vækst.

2. kloning af konstruktioner til CRISPR/Cas9-medieret mutagenese af P. andersonii

Bemærk: Standard binære transformation vektorer kan bruges til den stabile transformation af P. andersonii. Her, som et eksempel, er en procedure for at generere konstruktioner til CRISPR/Cas9-medieret mutagenese ved hjælp af modulære kloning (f. eks Golden Gate)19.

  1. Identificer guide RNA-målsekvenser for det eller de gener, der er af interesse, ved hjælp af Bioinformatik software med et indbygget CRISPR-design værktøj. Vælg guide RNA-sekvenser placeret på 5 '-enden af kodnings sekvensen af målgenet for at øge chancen for at opnå fuld knockouts. Sørg for at kontrollere for off-Target effekter ved at søge mod P. andersonii genom6.
    Bemærk: Brug 2 sgRNAs pr. målgen, fortrinsvis 200-300 BP fra hinanden. Dette kan medføre sletninger, der kan identificeres ved PCR og efterfølgende ved agrose gel elektroforese.
  2. Generer Level 1 Golden Gate konstruktioner, der indeholder sgRNA-sekvenser.
    1. Design primere at forstærke hver enkelt sgRNA ved at indsætte 20 BP guide sekvens på positionen af N(20) i følgende primer sekvens: 5 '-TGTGGTCTCAATTGN(20) gttttagagctagaaatagcaag-3 '.
      Bemærk: Hvis guide sekvensen er lig med GN(19), fjernes G ved 5 ' enden af guide sekvensen, før du indsætter i primer-sekvensen.
    2. PCR forstærke sgrnas fra pICH86966:: AtU6p:: sgRNA_PDS20 brug af Forward primere designet i trin 2.2.1 og Universal reverse primer: 5 '-tgtggtctcaagcgtaatgccaactttgtac-3 '. Brug en højteknologisk, varmestabil DNA-Polymerase og følgende PCR-betingelser: 98 °C i 30 s; 30 cyklusser (98 °C for 10 s; 53 °C for 20 s; 72 °C for 10 s); 72 °C i 7 min. vellykkede PCR-reaktioner giver en 165 BP amplicon.
    3. Kolonne-rense PCR amplikonen ved hjælp af en kommerciel PCR rensning kit. Efterfølgende, oprette Golden Gate reaktioner til klon sgRNAs bag Arabidopsis thaliana ATU6P lille RNA-promotor: 10 ng af sgRNA PCR amplicon, 150 ng af pICSL01009:: AtU6p20, 60 ng af passende niveau 1 acceptor vektor, 2 μl af T4 ubiquitinligase buffer, 2 μL 0,1% af bovin serumalbumin (BSA), 0,5 μL BsaI, 0,5 μL T4 ubiquitinligase, fyldes til 20 μL med ultra-rent vand. Sørg for, at alle sgRNAs klones i samme retning for at forhindre dannelse af Hårnåle.
    4. Incubate reaktioner i en termo cycler kører følgende program: 37 °C for 20 s; 26 cyklusser (37 °C i 3 min; 16 °C i 4 min); 50 °C i 5 min; 80 °C i 5 min. omdanne Golden Gate reaktioner på Escherichia coli og plade på lb medium21 indeholdende ampicillin (50 mg/l), X-gal (200 mg/l) og Iptg (1 mm).
      Bemærk: Forbered stamopløsninger af IPTG og X-gal i henholdsvis ultra-rent vand og dimethylformamid. Filter steriliserer ampicillin-og IPTG-stamopløsninger og opbevarer alle lagre ved-20 °C. Bær handsker ved håndtering af dimethylformamid.
    5. Vælg hvide kolonier og Isoler plasmider ved hjælp af et kommercielt plasmid isolationssæt. Sekvens Bekræft isolerede plasmid'er, før du fortsætter med Golden Gate Level 2-samlingen.
  3. Saml Level 2 Golden Gate konstruktioner til den stabile transformation.
    1. Udfør en Golden Gate reaktion ved hjælp af niveau 1 AtU6p:: sgRNA konstruktioner (genereret under afsnit 2,2) samt pICH47802::nptII, pICH47742:: 35sPro:: Ωnls-ACas9:: 35ster, niveau 2 acceptor pICSL4723 og den relevante end-linker (Se Engler et al.22). Udfør reaktioner som følger: Brug ~ 100 fmol af hver donor vektor og ~ 20 fmol af acceptor vektor og tilsæt 2 μL T4 ubiquitinligase buffer, 2 μL 0,1% BSA, 0,5 μL BpiI, 0,5 μL af T4 ubiquitinligase, fyld til 20 μL med ultra-rent vand.
      Bemærk: niveau 1 plasmider pICH47802::nptII, pICH47742:: 35sPro:: ωnls-aCas9:: 35ster skal klones først (Se supplerende fil 1), som er beskrevet for sgrnas i henhold til afsnit 2,220,22 ,23.
    2. Incubate reaktioner som under trin 2.2.4 og omdanne til E. coli. Plade på LB-medium, der indeholder kanamycin. Næste dag, Vælg hvide kolonier og Isoler Plasmids. Bestem den korrekte plasmid samling ved begrænsning-fordøjelse analyse.
  4. Transform Level 2 konstruktioner til Agrobacterium tumefaciens stamme AGL124.

3. stabil omdannelse af P. andersonii

  1. Inoculate 2 LB plader indeholdende de relevante antibiotika med en. tumefaciens stamme AGL1 omdannet med konstruktionen af interesse. Inkuber pladerne ved 28 °C i 2 dage.
  2. Høst unge grene fra drivhus-dyrkede træer. Brug ca. 5 grene med en længde på 5-8 cm til hver transformation. Sørg for kun at bruge sunde ikke-inficerede grene. Fjern bladene ved at skære dem som sådan, at ~ 1 cm2 af blad vævet er tilbage i slutningen af hver petiole. Kassér bladene.
  3. Desinficer vævet i 15 min ved hjælp af 1:1-fortyndet kommerciel blegemiddel (~ 2% hypochlorit efter fortynding) indeholdende et par dråber Polysorbat 20. Skyl derefter vævet 6 gange med autoklaveres vand.
    Bemærk: dette trin, samt, de følgende trin skal udføres inde i en laminar ned-flow kabinet til at holde væv steril.
  4. Re-suspendere a. tumefaciens celler fra 1-2 plader i 25 ml infiltration medium (Se tabel 1) indeholdende acetosyringone (20 mg/L) og et ikke-ionisk overfladeaktivt stof (0,001% v/v) at nå en optisk tæthed (OD600) af ~ 5.
    Bemærk: Forbered acetosyringone stamopløsningen i 70% ethanol og opbevar ved-20 °c. Det nonioniske overfladeaktive stof skal være filter steriliseret, før det tilføjes til infiltrations mediet.
  5. Skær både stammen og stilk vævet i stykker på ~ 1 cm i længden inde i A. tumefaciens suspension, hvorved der skabes friske sår på begge sider. Efterlad Vævsstykker i suspensionen A. tumefaciens i 10-30 min.
  6. Forbered rode mediet (Se tabel 1) og tilsæt acetosyringone (20 mg/L) efter autoklavering. Tør Vævsstykker på et sterilt stykke filtrerpapir og Anbring det på mediet (~ 10 explants/Plate). Inkuber pladerne i mørke ved 21 °C i 2 dage.
    Bemærk: Lad mediet køle ned til ~ 60 °c, før acetosyringone tilføjes.
  7. Efter 2 dage inspiceres pladerne for svampe eller åbenlys bakteriel kontaminering (andre bakterier end A. tumefaciens). Forurenede plader skal kasseres.
  8. Tilbered flydende SH-10-medium (Se tabel 1). Efter autoclaving tilsættes Polysorbat 20 (0,01%, v/v). Vævsstykker overføres til 10 mL af SH-10 indeholdende Polysorbat 20. I en periode på mindst 10 min, forsigtigt agitere hver 2-3 min til at vaske vævet.
  9. Vask to ekstra gange med frisk SH-10 indeholdende Polysorbat 20. Disse tider, en 2-3 min inkubationstid pr vaske trin er nok.
  10. Forbered rode mediet (Se tabel 1). Efter autoklave ingen tilsættes cefotaxim (300 mg/l) og kanamycin (50 mg/l) og hæld plader. For de sekundære transformationer (transformationer af transgene kanamycin-resistente linjer), anvende hygromycin (15 mg/L) udvælgelse.
  11. Tørre Vævsstykker på sterile stykker filtrerpapir. Derefter overføres Vævsstykker til pladerne, som er fremstillet i trin 3,9.
  12. Inkubér plader i 7 dage ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat. Hver 2 dage check plader for svampe eller bakteriel kontaminering og overdreven vækst af A. tumefaciens. I tilfælde af kontaminering overføres ikke-inficerede stykker til en frisk tallerken.
  13. Efter 7 dage overføres Vævsstykker til formerings medium (Se tabel 1), der indeholder cefotaxim (300 mg/l) og kanamycin (50 mg/l). Incubate plader ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat. Genopfrisk plader en gang om ugen, indtil transgene skud udvikler. Sørg for kun at overføre ikke-inficerede Vævsstykker til friske plader. Kassér de stykker, der er over groet af A. tumefaciens.
  14. Når putativt-transgene skud er ≥ 1 cm i længden, skære skud og kultur dem selvstændigt i formerings mediet indeholder cefotaxim (300 mg/l) og kanamycin (50 mg/l). At sikre, at skud repræsenterer uafhængige transformerende, tage kun en enkelt skyde fra hver side af en explant.
  15. Vegetativt udbrede putativt-transgene skud som beskrevet under trin 5,2.

4. genotypebestemmelse af putativt-transgene skud

  1. Design primere, som spænder over sgRNA Recognition site (s). For at tillade PCR amplikonen sekvensering skal du vælge primere 150-250 BP væk fra sgrna Recognition site (s).
  2. Skær en blad spids (~ 5 mm) fra hver transgene shoot, der skal Geno skrives. Også høste en vild-type kontrolprøve.
  3. Udfør 50 μL PCR-reaktioner ved hjælp af primere designet i trin 4,1 og et kommercielt kit til direkte at forstærke DNA fra plante prøver. Alternativt kan PCR-reaktioner udføres på renset DNA ved hjælp af en high-fidelity polymerase.
  4. Separate PCR amplikoner på en 1,5-2% agopstået gel.
  5. Analysér resultaterne fra gel elektroforese. Check for prøver, der producerer flere bands (mere end 1 allel) og PCR amplikoner med størrelser forskellige fra vildtype, hvilket indikerer tilstedeværelsen af mellemstore indeler.
  6. Sekvens PCR amplikoner til at identificere de nøjagtige mutationer. For prøver, der producerer en enkelt PCR amplicon, kan PCR-produkter sorteres direkte. Prøver, der producerer mere end 1 band efter gel elektroforese eller der synes at være heterozygot efter direkte sekvensering af PCR amplicon, skal klones i en stump-ende kloning vektor først. Derefter sekvens flere kloner for hver prøve for at identificere alle mulige alleler til stede i prøven.
  7. Justér sekvensering resultater til det gen af interesse og inspicere tilpasningen til at kontrollere for mutationer i nærheden af sgRNA Target site (s). Derefter kontrollere, om disse mutationer skabe frameshifts. Kassér linjer med > 2 alleler og linjer, der indeholder in-frame-mutationer.
  8. Vælg flere linjer til yderligere analyse.
  9. Overfør markerede linjer som beskrevet under trin 5,2.
  10. Når linjer har udviklet flere nye skud, tage nye prøver fra ≥ 3 blad spidser og Gentag trin 4.3-4.7. Afgøre, om mutationer i hver af prøverne, der stammer fra samme linje, samt den oprindelige PCR-prøve er identiske. Linjer, der giver de samme mutationer i alle prøver, er homogent muterede og kan anvendes til yderligere eksperimenter. Kassér linjer, der ikke giver de samme resultater, da disse linjer er chimeric.

5. forberedelse af rødder P. andersonii planteter til eksperimenter

  1. Initiere en ny vævskultur linje af P. andersonii.
    1. Høst axillær knopper, unge utilsigtede skud eller blad væv fra sunde træer. Alternativt kan frøplanter bruges som udgangsmateriale.
    2. Desinficer vævet ved hjælp af 1:1-fortyndet kommerciel blegemiddel (~ 2% hypochlorit efter fortynding) indeholdende et par dråber Polysorbat 20 i 15 min. bagefter skylles vævet 6 gange med autoklaveres vand.
      Bemærk: dette trin, samt, de følgende trin skal udføres inde i en laminar downflow eller laminar crossflow kabinet til at holde væv steril.
    3. Overfør vævet til formerings mediet (Se tabel 1). Luk plader med 2 lag elastisk tætnings folie og Inkubér plader ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat.
    4. Inspicer pladerne hvert par dage i løbet af de første 2 uger for at sikre, at vævet er fri for svampe-eller bakteriekontaminering.
  2. Udbrede væv ved at placere ~ 10 skud på en frisk plade af formering medium og lukke pladen med 2 lag af elastisk tætnings folie. Incubate plader ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat. Gentag dette trin hver 4 uger.
  3. Når skuddene er > 1 cm i længden, skæres skud på deres base og placere dem på rode medium (Se tabel 1). Omkring 10 skud kan placeres på en enkelt rode plade. Position skyder oprejst ved at indsætte den basale spids af skuddet i mediet. Rødder vises på 10-14 dage efter inkubation af pladerne ved 28 °C, 16 h:8 h dag: nat.
    Bemærk: du må ikke udrydde alle skud, men holde en del for vævskultur formering (Se trin 5,2).

6. nodulation af P. andersonii plantlets i Potter

  1. Forbered Rhizobium inoculum.
    1. 10 mL flydende YEM-medium (Se tabel 2) fra en enkelt koloni af Mesorhizobium plurifarium BOR26 og inkubateres ved 28 °c i 2 dage.
      Bemærk: M. plurifarium BOR2 foretrækkes, da det effektivt nodulates P. andersonii. Men, andre Rhizobium stammer kan også anvendes til nodulation af P. andersonii (f. eks bradyrhizobium elkanii WUR325, Rhizobium tropici CIAT89926,27 eller bradyrhizobium Sp. Kelud2A4).
    2. Brug 10 mL kulturen til at inokulere et større volumen af flydende YEM medium. Mængden af denne kultur er afhængig af antallet af Potter, der skal inokuleres.
    3. Forbered flydende EKM-medium (Se tabel 3, skema 4). Centrifuger bakterie kulturen i 10 minutter ved 3.500 x g for at høste cellerne. Derefter igen suspendere bakteriel pellet i flydende EKM (brug omtrent samme volumen som den oprindelige YEM kultur) og bestemme den optiske tæthed (OD600).
  2. For ~ 20 Potter, Forbered 3 L flydende EKM medium og podes med rhizobial suspension forberedt på trin 6.1.3. for at nå OD600 = 0,025.
  3. Bland 3 L EKM indeholdende rhizobia med 1.250 g perlit. Derefter tilsættes 210 g af denne blanding til sterile gennemskinnelige polypropylen Potter. Alternativt, i stedet for perlite, bruge sand som et substrat for nodulation assays.
  4. Plant 1-3 P. andersonii plantlets i hver gryde. Også forberede flere Potter, der indeholder P. andersonii plantlets OMDANNET med crispr-Control konstruktionen (Se supplerende tabel 1). Afvejes flere Potter for at kunne bestemme vandtab under eksperimentet. Dæk bunden af hver gryde til at beskytte rødderne mod lys eksponering.
  5. Incubate Potter i en klimatiseret vækst værelse (28 °C, 16 h:8 h dag: nat) for 4-6 uger. En gang om ugen, vejer flere Potter til at bestemme vand tab. Hvis vandtabet overstiger 10 mL, supplere med ultra-rent vand for at kompensere for tabet.
  6. Efter 4-6 uger, rense rødderne fra perlit og bestemme knude numre ved hjælp af en binokulær at undersøge den nodulation effektivitet.

7. nodulation af P. andersonii plantlets på plader

  1. Forbered cellofan membraner 28.
    1. Skær cellofan membranen til at passe ind i en firkantet 12 cm x 12 cm Petri skål. Skær membranerne lidt kortere i toppen for at give plads til skuddene til at vokse.
    2. For at øge permeabiliteten af cellofan membraner, kog membranerne i EDTA opløsning (1 g/L) i 20 min. bagefter skylles mindst 6x med demineraliseret vand for at fjerne EDTA.
      Bemærk: da den tørre membran har tendens til at rynke, når den er i kontakt med vand, nedsænkes de tørre membraner én efter én i opløsningen.
    3. Placer membranerne vandret i et tyndt lag vand i en rund glasplade. Steriliser membranerne ved at autoklave to gange.
  2. Placer 1 autoklaveres cellofan membran på en firkantet 12 x 12 cm Petri skål indeholdende agar-solidificeret EKM medium (Se tabel 3, tabel 4). Placer to 3-ugers gamle rødder P. andersonii plantlets (Se afsnit 5) eller 4-ugers gamle frøplanter (se afsnit 1,1) på toppen af membranen. Sørg for kun at plukke plantlets eller frøplanter med rødder, der har hvide rod tips, hvilket indikerer, at disse rødder stadig vokser.
  3. Forsigtigt dække rødderne med en anden cellofan membran, skabe en sandwich lag. Forsegl pladen med 3 lag elastisk tætnings folie. Wrap den nederste halvdel af pladerne med aluminiumsfolie, til at dække rødderne fra lys eksponering.
  4. Inkubér pladerne i et klimatiseret væksrum (28 °C, 16 h:8 h dag: nat) i 3-4 uger. Markér placeringen af root tips til at følge roden vækst over tid.
  5. Hvis EKM-pladerne begynder at tørre ud på grund af forlænget inkubation, skal planterne overføres til friske EKM-plader et par dage før bakteriel inokulation.
  6. Den bakterielle inokulum forberedes som beskrevet i trin 6,1.
  7. Fjern den øverste cellofan membran og anvende 1 ml Rhizobium kultur (OD600 = 0,025) til rødderne. Derefter placeres en ny cellofan membran på de inokulerede rødder. Wrap yder linjen af pladen ved hjælp af aluminiumsfolie til at dække rødderne fra lys eksponering.
  8. Efter 4 uger, undersøge knude numre ved hjælp af en binokulær at bestemme den nodulation effektivitet.

8. nodulation af P. andersonii frøplanter i poser

  1. Spire P. andersonii frø som beskrevet i afsnit 1,1. Efter de kimbladene er helt dukket op (~ 12 dage på sh-0 plader ved 28 °c), overføre frøplanterne til poser.
  2. For at tilberede punge skal du rive den foldede del af papir vægen og tilføje 7 mL modificeret EKM-medium (Se tabel 3, tabel 4).
  3. Indsæt 1 eller 2 frøplanter ved at placere rødderne i mellem begge ark papir, der danner papir vægen og den forreste plastik plade af posen.
  4. Skjold rødderne fra lys eksponering, ved at folde aluminiumsfolie rundt om posen. Afbryd poser i en plastikæske dækket med et gennemsigtigt låg for at opretholde høj luftfugtighed. Placer kassen i et klimatiseret væksrum (28 °C, 16 h:8 h dag: nat).
  5. Kompensere for vand fordampning ved tilsætning af sterilt ultra-rent vand, således at papir vægen forbliver fugtigt (undgå stående vand i bunden af posen). Efter den første uge, dette generelt kræver tilsætning 2-3 ml hver 4 dage.
  6. Den bakterielle inokulum forberedes som beskrevet i trin 6,1.
  7. Efter at frøplanterne er blevet dyrket i 10-12 dage i poser, podes rodsystemet med 500 μL Rhizobium kultur (OD600 = 0,025).
  8. Følg knude formation gennem tiden. Fire uger post inokulation, knuder kan tælles og høstes for at bestemme nodulation effektivitet.

9. nodule Cytoarchitecture analyse

  1. Saml 10-15 knuder i et 2 mL rør indeholdende fiksativ (5% glutaraldehyd i 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2). Påfør vakuum til 1/2-1 h og Inkuber natten over ved 4 °C. I denne periode, prøverne synke til bunden af røret.
    Bemærk: fikativ opløsningen kan opbevares ved 4 °c i ~ 2-4 uger tidligere brug. Sørg for at bære handsker, når du arbejder med vævs fikativ.
  2. Vask knuder 2x med 0,1 M fosfatbuffer, pH 7,2. Anvend 10 min. intervaller mellem hvert vaske trin.
  3. Dehydrat prøverne ved efterfølgende inkupering i 30%, 50%, 70% og 100% ethanol. For at sikre, at alt vand fjernes fra prøverne, gentages 100% ethanol Step 3x. Anvend 10 min. intervaller mellem hvert dehydre Rings trin.
  4. Forbered polymeriserings blandingen I (PM-I) ved at tilføje 1 pakke Hærer I til 2,5 mL PEG400 blandet med 100 mL HEMA (2-hydroxyethylmethacrylat)-baseret harpiks opløsning. Opløsningen omrøres til ~ 15 min for at opløse Hærden I. Derefter opbevares PM-I ved-20 °C.
  5. Fjern ethanol fra trin 9,3. og infiltrere prøverne i følgende rækkefølge: PM-I:100% ethanol (1:3, v/v), PM-I:100% ethanol (1:1, v/v), og PM-I:100% ethanol (3:1, v/v). Prøverne inkubates i hver opløsning ved RT for 1/2-1 h, eller indtil prøverne synker til bunds.
  6. Incubate prøver natten over ved 4 °C i 100% PM-I opløsning.
  7. Forbered polymeriserings blandingen II ved at blande PM-I og Hardener II i et 15:1 (v/v)-forhold. Fyld plastik formen med polymeriserings opløsningen, drej prøverne vandret i bunden af formen, og dæk med et stykke elastisk tætnings folie. Undgå dannelse af luftbobler.
    Bemærk: da opløsningen begynder at polymerisere ved udsættelse for rt, så prøv at orientere prøverne så hurtigt som muligt i plastik holderen. Polymerisering er afsluttet efter natten inkubation ved RT, eller 1 h ved 37 °C.
  8. Fjern det elastiske tætnings folie dæksel fra trin 9,7 og Anbring en holder til de polymeriserede prøver. For at montere holderen på prøverne opløses 10 mL methylmethacrylat-baseret harpiks pulver i 5 mL methylmethacrylat-baseret harpiks opløsning. Tilføj hurtigt opløsningen til hullet i toppen af holderen.
    Bemærk: Udfør polymeriserings trinnet i røghætten (~ 30 min ved RT).
  9. Mikrotom sektions prøver til en tykkelse på 4-5 μm. Placer et mikroskop slide på en 58 °C varm plade og tilsæt en stor dråbe vand til hvert dias. Placer sektionerne på toppen af vandet. Når vandet er fordampet, vil afsnittene holde sig til diaset.
  10. Pletten glider ved at fordybe i 0,05% (w/v) toluidin blå i 2 min. Skyl derefter slides 3x med ultra-rent vand. Slides kan observeres ved hjælp af en lys-felt mikroskop.

10. mycorrhization af P. andersonii plantlets

  1. Forbered rhizophagus irregularis sporer ' inokulum
    1. Forbered en stak polyester vævede filtre med følgende størrelser (top til bund): 210 μm, 120 μm og 36 μm maskestørrelse.
    2. Pipetten den nødvendige mængde af en kommerciel spore suspension på stakken af polyester filtre. Skyl filtrene 3x med 100 ml autoklaveres demineraliseret vand. Sporerne bevares på overfladen af 36 μm-filteret.
      Bemærk: Forbered sporesuspensionen i laminar crossflow-kabinettet for at forhindre kontaminering.
    3. Skil polyester stakken ad, og Behold kun 36 μm-filteret. Gentag vaske trinnet med autoklaveres demineraliseret vand i mindst 6x.
    4. Anbring filteret på en Petri skål og re-suspendere sporer i autoksin demineraliseret vand. Brug en mængde vand svarende til den mængde spore affjedring, der anvendes i trin 10.1.2. Spore-suspensionen overføres til et sterilt rør ved pipettering.
    5. Anbring 5 dråber 20 μL spore ophænget på en glas rutsjebane, og Tæl antallet af sporer ved hjælp af et lysfelt mikroskop. Konverter spore tæller til et forhold mellem sporer/mL og fortynder sporesuspensionen, indtil den når 250 sporer/mL. Sporeopslæmning opbevares ved 4 °C.
  2. Udføre mycorrhization assay. Med henblik herpå tilsættes 800 g autoklaveret sand suppleret med 70 mL 1/2-Hoagland medium til sterile gennemskinnelige polypropylenpotter (Se tabel 5-6). Bland sand og medium direkte i gryden ved at ryste kraftigt.
  3. Placer en P. andersonii plantlet i hver gryde, og pipetten 1 ml af sporesuspensionen direkte på roden af p. andersonii plantlet. Sørg for at inkludere flere Potter, der indeholder P. andersonii planteter, som er omdannet med en crispr-Control-konstruktion (Se supplerende tabel 1).
  4. Incubate Potter i en klimatiseret vækst værelse (28 °C, 16 h:8 h dag: nat) for 6 uger.
  5. Tag planterne ud af potterne og vask rødderne med rindende vand for at fjerne så meget sand som muligt.
  6. Skær rødder i 1 cm lange stykker og kog rodstykkerne i 10% KOH (w/v) i 20 min ved 90 °C. Placer derefter de kogte rødder på en cellefilter med en 100 μm maskestørrelse og skyl 3x med 50 mL vand.
  7. Plette rødder med 0,05% (w/v) trypan og et blå i lactoglycerol (300 mL mælkesyre; 300 mL glycerol og 400 mL demineraliseret vand) i 5 min ved 90 °C i et vandbad eller en varmeblok. Derefter overføre rødder til 30% glycerol. Rodprøverne kan lagres på RT.
  8. Placer 15-25 rodfragmenter på et enkelt mikroskopdias. Tilsæt 30% glycerol og dæk med et cover glas, og tryk på, indtil rodstykker bliver flade. Observere roden fragmenter ved hjælp af en lys-felt mikroskop og score mykorrhizasvampene kolonisering.
    Bemærk: en metode til at score mycorrhization er beskrevet i henhold til Trouvelot et al.29. Denne metode bruger flere klasser (% F,% M og% A), som gør det muligt hurtigt at anslå niveauet af mykorrhizasvampene kolonisering af hvert rod fragment og overflod af arbuscules.

Representative Results

P. andersonii tRees kan dyrkes i et konditioneret drivhus ved 28 °c og ~ 85% relativ luftfugtighed (figur 1a). Under disse betingelser, træer begynder blomstring på 6-9 måneder efter plantning. Kvindelige P. andersonii blomster producerer bær, der hver indeholder en enkelt frø. Under modning skifter bærrene farve; først fra grøn til hvid og derefter fra hvid til brun (figur 1b). Frø ekstraheret fra de modne brune bær, spire godt efter en 10-dages temperaturcyklus og en 7-dages inkubation på SH-0 plader (figur 1c). Germinerede frø fortsætte med at udvikle sig til unge frøplanter, der kan bruges til eksperimenter efter ~ 4 uger (figur 1d).

Vi har tidligere vist, at stilke og segmenter af unge P. andersonii stilke kan effektivt omdannes ved hjælp af en. tumefaciens stamme AGL110. Ved indledningen af Transformations proceduren er vævs explanterne meddyrket med A. tumefaciens i 2 dage ved 21 °C (figur 2a). Forlænget Co-dyrkning resulterer i over koloniseringen af vævs bruskeksplantater af A. tumefaciens og bør derfor forhindres (figur 2b). Efter den fælles dyrkningsperiode overføres vævs bruskeksplantater til selektive medier, hvilket fremmer udvækst af omdannet væv. To til tre uger senere, små grønne mikro-Calli er generelt observeret langs den oprindelige såroverfladen (figur 2c). Disse Calli bør fortsætte med at vokse og udvikle 1 eller flere putativt forvandlet skud på 6-8 uger efter omdannelsen procedure er blevet indledt (figur 2D). På nuværende tidspunkt spænder Transformations effektiviteten typisk fra ~ 10-30% for transformationer, der indledes med vævs bruskeksplantater taget fra modne og delvist træagtige grene (tabel 7). Hvis transformationer indledes med bruskeksplantater taget fra de unge og hastigt voksende spidser af grene, der endnu ikke er forsynet med blomster, kan der opnås Transformations effektivitet på ~ 65-75% (tabel 7). Lejlighedsvis dannes hvidlig Calli på siden af en explant, der ikke er i kontakt med mediet, og derfor ikke oplever kanamycin udvælgelse. Disse Calli er ofte ikke transgene og eventuelle skud dannet af disse Calli vil generelt blegemiddel og dø efter direkte kontakt med kanamycin-holdige medium (figur 2E). Hvis Transformations hastigheden er lav, og/eller udgangsmaterialet var suboptimalt, kan Vævsstykker blive brune (figur 2F) og lider af over-spredning af A. tumefaciens (figur 2g). For at forhindre A. tumefaciens i at sprede og over vokse nærliggende bruskeksplantater, regelmæssig forfriskning af mediet er nødvendig, og alvorligt inficerede bruskeksplantater skal fjernes. Når individuelle transgene skud er placeret i formering medium, over-spredning af A. tumefaciens er generelt ikke forekommer længere (figur 2H). Transgene skud kan ganges gennem in vitro-formering, som vil give anledning til snesevis af skud i en periode på en måned (figur 3a-B). Disse skud kan placeres på rode medium, som skal inducere roddannelse efter ~ 2 uger (figur 3C-D). Rodfæstede plantlets kan efterfølgende anvendes til eksperimenter.

For at skabe knockout mutant linjer gør vi brug af CRISPR/Cas9-medieret mutagenese. Til dette formål gør vi brug af en binær vektor, der indeholder kanamycin resistensen gen nptII, en Cas9-kodnings sekvens drevet af CaMV35S promotoren og 2 sgRNAs pr. målgen, der udtrykkes fra den ATU6P lille RNA-promotor20. I figur 4afindes en grafisk gengivelse af den konstruktion, der anvendes til crispr/Cas9-medieret mutagenese af P. andersonii . Ved hjælp af denne metode, genom redigering er observeret i ~ 40% af putativt forvandlet skud10. For at identificere mutant linjer, er putativt transformerede skud Geno skrives for mutationer på sgRNA-målstedet (-erne) ved hjælp af primere, der spænder over målområdet. Figur 4giver et eksempel på de forventede resultater. Som det kan ses fra billedet taget efter gel elektroforese, flere prøver producerer en PCR amplikonen med tilsvarende størrelse til vildtype (figur 4b). Disse planter kan indeholde små indeler, der ikke kan visualiseres af agrose gel elektroforese eller forblive uredigeret af Cas9 enzymet. Derudover er der flere prøver, som giver forskellige størrelser fra Wild typen (f. eks. linje 2, 4, 7 og 8 i figur 4b). I disse linjer, 1 (linjer 4, 7 og 8) eller begge (linje 2) alleler indeholder større indeler, der let kan visualiseres. Den nøjagtige karakter af mutationer på målet site (s) er afsløret efter PCR amplikonen sekvensering. Som det fremgår af figur 4c, kan både små indler af 1-4 BP samt større sletninger opnås efter crispr/Cas9 mutagenese. I figur 4cer sekvensen af linje 1 identisk med Wild typen, hvilket indikerer, at denne linje undslap redigering og derfor bør kasseres. Blandt de linjer, der indeholder mutationer, kan heterozygot, homozygot og bialleliske mutanter identificeres (figur 4c). Heterozygot mutanter er dog generelt sjældne10. Homozygot eller bialleliske knockout-mutanter kan overføres vegetativt for at opnå tilstrækkeligt materiale til fænotypisk analyse. Da fænotypisk analyse udføres i T0 generation, er det vigtigt at kontrollere, om mutant linjer kan være chimerisk. Med henblik herpå skal genotypebestemmelse gentages på mindst 3 forskellige prøver udtaget fra hver mutant linje. Hvis genotype resultaterne er identiske med hinanden og den oprindelige genotype prøve (f. eks. linje 8 i figur 4d), er linjen homogent muteret og kan anvendes til yderligere analyse. Hvis resultaterne af genotypebestemmelse er forskellige fra uafhængige prøver (f. eks. linje 4 i figur 4d), er den mutante linje dog chimerisk og skal kasseres.

Inokulering af P. andersonii med M. plurifarium BOR2 resulterer i dannelsen af rodknuder (figur 5). Som det kan ses i figur 5a, disse knuder er fordelt langs rodsystemet. Knuder af P. andersonii er lysebrune i farve, men kan let diskrimineres fra rodvævet baseret på deres form (figur 5b). Inokulation eksperimenter i Potter og efterfølgende vækst i 4-6 uger typisk resultere i dannelsen af ~ 10-30 knuder (figur 6a). Et lignende antal knuder dannes efter inokulering af EKM plade-dyrkede P. andersonii plantlets ved 4 uger efter inokulation (figur 6a). I poser, P. andersonii frøplanter typisk form ~ 5-15 knuder ved 5 uger post inokulation (figur 5C-D, 6a). For at analysere knude cytoarchitecture, knuder kan opdeles og observeres ved hjælp af lyse-Field mikroskopi. Figur 6b viser et eksempel på et langsgående afsnit gennem midten af en P. andersonii nodule. Dette afsnit viser den centrale vaskulære bundt af en P. andersonii knude, som er flankeret af knude lapper, der indeholder inficerede celler (figur 6b).

P. andersonii plantlets kan også være mykorrhized. Efter 6 ugers inokulation med R. irregularis, når mykorrhizasvampene koloniserings frekvensen typisk > 80% (figur 6c). På dette tidspunkt, generelt ~ 30% af cellerne indeholder arbuscules (figur 6c). Et repræsentativt billede af et P. andersonii rodsegment, der indeholder arbuscles, er vist i figur 6d.

figure-representative results-8515
Figur 1: repræsentative billeder af en P. andersonii træ, frø og frøplanter. (A) seks måneder gamle P. andersonii træ dyrket i pottejord i et drivhus konditioneret ved 28 °c. (B) repræsentative billede skildrer P. andersonii bær på forskellige stadier af modning. Unge P. andersonii bær (umodne) vil skifte farve fra grøn til hvid og endelig til brun (moden) ved modning. (C) P. andersonii frø inkuberet på sh-0 medium i 1 uge. En sort cirkel indikerer en spirende frøning. D) fire uger gamle P. andersonii -FRØPLANTER dyrket i sh-0-medium. Skala stænger er lig med 25 cm i (a) og 1 cm i (B-D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

figure-representative results-9617
Figur 2: repræsentative billeder af bruskeksplantater på forskellige stadier af den stabile Transformations procedure. (A) explant Co-dyrket med A. tumefaciens. B) explant overgroet af A. tumefaciens i løbet af de første 2 uger efter omdannelsen. C) transgene mikro-callus dannet nær sårstedet for en explant ved 2,5 uger efter Co-dyrkning. (D) repræsentativt billede af en explant på 6 uger efter Co-dyrkning viser fremkomsten af skud fra (transgene) Calli. (E) repræsentativt billede af en optagelse, der bliver hvidlig og til sidst dør, når den er i direkte kontakt med kanamycin-holdige medium. Denne optagelse er mest sandsynligt ikke-transgene og undslap kanamycin udvælgelse når den er fastgjort til explant. F) repræsentativt billede af en ikke-succesfuld forvandlet forklaring. G) repræsentativt billede af en uden held forvandlet forklarer, der er over groet af A. tumefaciens. (H) enkelt transgene shoot dyrket på formerings medium ved 8 uger efter Co-dyrkning med A. tumefaciens. Skala stænger lig med 2,5 mm. kasser med grønne markeringer eller Røde Kors indikerer henholdsvis vellykket eller mislykket omdannelse af explants. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

figure-representative results-11246
Figur 3: repræsentative billeder af in vitro udbredelse. (A) skud dyrket på formerings medium. Billedet blev taget 1 uge efter pladerne blev opdateret. B) skud dyrket på formerings medium. Billedet blev taget 4 uger efter pladerne blev opdateret. C) nyskårne skud anbragt på rode medium. (D) skyder inkuberet på rode medium i 2 uger. Bemærk tilstedeværelsen af rødder. Skala stænger er lig med 2,5 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.

figure-representative results-12067
Figur 4: repræsentative resultater efter genotypebestemmelse af P. andersonii T0 transgene crispr/Cas9 mutant Lines. A) repræsentativt kort over en binær vektor, der anvendes til crispr/Cas9-medieret mutagenese af P. andersonii. B) repræsentativt resultat efter PCR-baseret genotypebestemmelse af potentielle crispr/Cas9 mutant linjer ved hjælp af primere, som spænder over sgRNA-målstedet (-erne). Vist er et billede efter agopstået gel elektroforese af amplicons. Prøver udtaget fra individuelle transgene linjer er angivet med tal. Wild type (WT) og ingen Template Control (NTC) angiver baner, der indeholder henholdsvis positive og negative kontroller. C) skematisk gengivelse af mutant alleler opnået efter crispr/Cas9-medieret genredigering. Fremhævet i blå og røde farver er de sgRNA mål sites og PAM sekvenser, hhv. D) repræsentativt resultat efter PCR-baseret screening for potentielle chimeriske mutante linjer. Vist er et billede efter agrose gel elektroforese af 3 individuelle prøver taget fra mutant linje 4 og 8. Bemærk, at transgene mutant Line 4 er chimerisk. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

figure-representative results-13560
Figur 5: repræsentative billeder af nodulation assays i plader og poser. A) nodulering på plader indeholdende agar-solidificeret EKM medium og inokuleret med M. plurifarium BOR2 i 4 uger. B) repræsentativt billede af en P. andersonii root nodule. Billedet blev taget på 4 uger post inokulation med M. plurifarium BOR2. C) nodulering i poser med flydende EKM-medium. Frøplanter blev inokuleret med Bradyrhizobium Sp. Kelud2A4 i 5 uger. D) repræsentativt billede af et komplet setup, der anvendes til nodulation i poser. Skala stænger er lig med 2,5 cm i (A, C), 1 mm i (B), og 5 cm i (D). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

figure-representative results-14620
Figur 6: repræsentative resultater af nodulation og mycorrhization assays. A) repræsentativt bjælkediagram, der viser antallet af knuder dannet pr. anlæg efter 4 uger post podning med M. plurifarium BOR2 i potter eller på plader og ved 5 uger efter inokulering med Bradyrhizobium Sp. Kelud2A4 i poser. Data repræsenterer middelværdien ± SD (n = 10). B) repræsentativt billede af et langsgående afsnit gennem en knude dannet ved 4 uger efter inokulering med M. plurifarium BOR2. Afsnittet er farvet med toluidin blå. C) repræsentativt søjlediagram, der viser kvantificering af mykorrhisering. Variabler kvantificeret i henhold til Trouvelot et al.29 er F, hyppigheden af analyserede rodfragmenter, der er mykorrhized; M, intensiteten af infektion; A, den overflod af modne arbuscules i det samlede rodsystem. Mycorrhization blev kvantificeret ved 6 uger efter inokulering med R. irregularis (stamme DAOM197198). Data repræsenterer middelværdien ± SD (n = 10). (D) repræsentativt billede af modne arbuscules til stede i P. andersonii Root kortikale celler ved 6 uger efter inokulering med R. irregularis. Skala stænger lig med 75 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

SammensatteSH-0SH-10Formerings mediumRooting mediumInfiltration medium
SH-basal salt medium3,2 g3,2 g3,2 g3,2 g3,2 g
SH-vitaminblanding1 g1 g1 g1 g1 g
Saccharose-10 g20 g10 g10 g
BAP (1 mg/mL)--1 mL (4,44 μM)--
IBA (1 mg/mL)--100 μL (0,49 μM)1 mL (4,92 μM)-
NAA (1 mg/mL)---100 μL (0,54 μM)-
1 M MES pH = 5.83 mL3 mL3 mL3 mL3 mL
1 M KOHJuster pH til 5,8Juster pH til 5,8Juster pH til 5,8Juster pH til 5,8Juster pH til 5,8
Daishin agar8 g-8 g8 g-

Tabel 1: sammensætningen af Schenk-Hildebrandt-baserede30 medier, der anvendes til dyrkning af P. andersonii -frøplanter, stabil transformation og in vitro -formering. Faste forbindelser opløses i 750 mL ultra-rent vand før tilsætning af flydende lagre. Bagefter fylder det komplette medium til 1 L. Forbered BAP, IBA, NAA bestande i 0,1 M KOH og opbevar ved-20 oC.

Før autoklave ingen:
SammensatteBeløb pr. literEndelig koncentration
Mannitol5 g27,45 mM
Na-gluconat5 g22,92 mM
Gær ekstrakt0,5 g-
MgSO4· 7h2O0,2 g0,81 mM
Nacl0,1 g1,71 mM
K2HPO4 0,5 g2,87 mM
Efter autoklave Rens:
SammensatteBeløb pr. literEndelig koncentration
1,5 M CaCl2 1 mL1,5 mM

Tabel 2: sammensætning af gær-Mannitol (YEM) medium, der anvendes til dyrkning af Rhizobium. Juster pH-værdien til 7,0, og fyld med ultra-rent vand til 1 L. Til klargøring af agar-solidificeret YEM medium tilsættes 15 g mikroagar før autoklave.

Før autoklave ingen:
SammensatteBestand koncentrationBeløb pr. liter mediumEndelig koncentration
KH2po4 0,44 MTilsæt 2 mL0,88 mM
K2HPO4 1,03 MTilsæt 2 mL2,07 mM
500x Micro-Elements stamopløsning-Tilsæt 2 mL-
MES pH = 6.61 MTilsæt 3 mL3 mM
Hcl1 MJuster pH til 6,6-
Ultra-rent vand-Fyld til 990 mL-
Efter autoklave Rens:
SammensatteBestand koncentrationBeløb pr. liter mediumEndelig koncentration
MgSO4· 7h2O1,04 M2 mL2,08 mM
Na2so4 0,35 M2 mL0,70 mM
NH4No3 0,18 M2 mL0,36 mM
CaCl2· 2H2O0,75 M2 mL1,5 mM
Fe (III)-citrat27 mM2 mL54 μM

Tabel 3: sammensætning af 1 L modificeret EKM medium31 anvendes til P. andersonii nodulation assay. Sammensætningen af 500x Micro-Elements stamopløsning er angivet i tabel 4. For at tilberede 2% agar-solidificeret EKM medium tilsættes 20 g Daishin agar før autoklave. Autoklave MgSO4· 7h2o, na2så4, CaCl2· 2H2o, og FE (III)-citrat bestande at sterilisere. Filter sterilisere NH4No3 stamopløsning til sterilisering.

SammensatteBeløb pr. literBestand koncentration
MnSO4 500 mg3,31 mM
ZnSO4· 7h2O125 mg0,43 mM
CuSO4· 5H2O125 mg0,83 mM
H3bo3 125 mg2,02 mM
Na2MoO4· 2H2O50 mg0,21 mM

Tabel 4: sammensætning af 500x Micro-Elements stamopløsning, der anvendes til tilberedning af modificeret EKM-medium. Opbevar mikrobestandenes stamopløsning ved 4 °C.

ForbindelserBestand koncentrationBeløb pr. liter mediumEndelig koncentration
K2HPO4 20 mM1 mL0,2 mM
NH4No3 0,28 M10 mL2,8 mM
MgSO4 40 mM10 mL0,4 mM
K2så4 40 mM10 mL0,4 mM
Fe (II)-EDTA9 mM10 mL0,9 mM
CaCl2 80 mM10 mL0,8 mM
50x Micro-Elements stamopløsning-10 mL-

Tabel 5: sammensætning af 1/2-Hoagland32 medium, der anvendes til mycorrhization assays. Sammensætningen af 50x Micro-Elements stamopløsning er angivet i tabel 6. Forbered FE (II)-EDTA-opløsningen ved at kombinere FeSO4· 7h2O (9 mm) og na2· EDTA (9 mM) til 1 stamopløsning og opbevares ved 4 °C. Juster pH af mediet til 6,1 ved hjælp af 1 M KOH og fyld med ultra-rent vand til 1 L.

ForbindelserBeløb pr. literBestand koncentration
H3bo3 71,1 mg1,15 mM
MnCl2· 4h2O44,5 mg0,22 mM
CuSO4· 5H2O3,7 mg23,18 μM
ZnCl2 10,2 mg74,84 μM
Na2Moo4· 2H2O1,2 mg4,96 μM

Tabel 6: sammensætning af 50x Micro-Elements stamopløsning, der anvendes til tilberedning af 1/2-Hoagland medium.

Alder af bruskeksplantaterForandrings effektivitet
Unge69,4 ± 6,2% (n = 2)
Modne18,3 ± 10,2% (n = 15)

Tabel 7: transformation effektivitet af P. andersonii. Her defineres Transformations effektivitet som procentdelen af bruskeksplantater, der danner mindst 1 transgene hård hud eller skyder. Transformations effektiviteten blev scoret efter 6 ugers transformation og er afbildet som middelværdien ± SD. n angiver antallet af Transformations eksperimenter, hvorfra Transformations effektiviteten blev fastlagt.

Supplerende fil 1: oversigt over niveau 1-og niveau 2-konstruktioner, der anvendes til CRISPR/Cas9 mutagenese. Venligst klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Bælgplanter og den distantly-relaterede cannabaceae slægten parasponia repræsenterer de eneste to clader af plantearter, der er i stand til at etablere et endosymbiotisk forhold til kvælstofbindende rhizobia og danne rodknuder. Sammenlignende undersøgelser mellem arter af begge clader er yderst relevante for at give indsigt i de centrale genetiske netværk, der muliggør denne symbiose. I øjeblikket udføres genetiske undersøgelser hovedsagelig i bælgplanter; især de to model arter M. truncatula og L. japonicus. For at give en ekstra eksperimentel platform og lette sammenlignende undersøgelser med en nodulating ikke-bælgfrugter, vi beskriver her en detaljeret protokol for stabil omdannelse og omvendte genetiske analyser i P. andersonii. Den præsenterede protokol bruger in vitro-formering af T0 transgene P. andersonii linjer, så fænotypiske analyse skal påbegyndes inden for 4 måneder efter en. tumefaciens Co-dyrkning. Dette er væsentligt hurtigere end de nuværende protokoller, der er blevet etableret for stabil omdannelse af bælgplanter33. Dette gør P. andersonii en attraktiv forskningsmodel.

Den protokol, der er beskrevet her, indeholder flere kritiske trin. Det første vedrører frøspire evnen. For at forberede P. andersonii frø til spiring, frø skal isoleres fra bærrene. Dette gøres ved at gnide bærrene på et stykke silkepapir eller mod indersiden af en te sigte. Denne procedure skal udføres forsigtigt for at forhindre beskadigelse af frøfrakke. Hvis frøbelægningen bliver beskadiget, kan blegemiddel trænge ind i frøet under steriliseringen, hvilket reducerer frøenes levedygtighed. For at bryde frø dormancy, frø er udsat for en 10-dages temperaturcyklus. Men på trods af denne behandling, spiring er ikke helt synkroniseret. Generelt, de første frø viser af fremkomsten efter 7 dage, men andre kan tage flere dage længere tid at spire.

Kritiske punkter i Transformations proceduren vedrører valget af udgangsmaterialet og varigheden af det fælles dyrknings trin. For at opnå en effektiv transformation er det bedst at bruge sunde og unge stilke eller petioler af ikke-sterile væksthusplanter som udgangsmateriale. For at inducere væksten af unge grene, er det tilrådeligt at trimme Parasponia træer hver 2-3 måneder og genopfriske træer en gang om året. Derudover skal Co-dyrkning trin kun udføres i 2 dage. Forlænget Co-dyrkning fremmer over kolonisering af vævs bruskeksplantater af A. tumefaciens og reducerer generelt Transformations effektiviteten. For at forhindre over kolonisering af A. tumefaciens er det også vigtigt regelmæssigt at opdatere de plader, som explanterne dyrkes på. Hvis der forekommer over kolonisering, kan vævs bruskeksplantater vaskes (Se afsnit 3,8) for at fjerne en. tumefaciens -celler. Vi anbefaler at tilføje blegemiddel til SH-10 opløsning, der anvendes til vask (endelig koncentration: ~ 2% hypochlorit). Det er vigtigt at bemærke, at dette ekstra vaske trin måske ikke virker på stærkt inficerede bruskeksplantater (figur 2b). Hvis en omdannelse med en CRISPR/Cas9-konstruktion kun giver et begrænset antal putativt transformerede skud, eller hvis mutagenese af et bestemt gen forventes at give problemer i regenerering, tilrådes det at inkludere en tom vektorkontrol konstruktion som den positive kontrol. Endelig er det vigtigt at sikre, at alle transgene linjer, der udvælges, er et resultat af uafhængige T-DNA-integrations hændelser. Derfor, vi instruere til at tage kun en enkelt putativt-transgene skyde fra hver side af en explant. Men vi indser, at dette reducerer det potentielle antal uafhængige linjer. Hvis mange linjer er nødvendige, forskerne kunne beslutte at adskille putativt forvandlet Calli fra de oprindelige bruskeksplantater, når disse Calli er ≥ 2 mm i størrelse og kultur disse Calli selvstændigt. På denne måde kan flere linjer isoleres fra hver explant, hvilket øger antallet af potentielle transgene linjer.

I den nuværende protokol, transgene linjer af P. andersonii er formeret vegetativt gennem in vitro-formering. Fordelen ved dette er, at mange transgene plantlets kan genereres i en relativt kort tidsperiode. Men, denne metode har også flere begrænsninger. For det første er vedligeholdelsen af T0 transgene linjer gennem in vitro-formering arbejdskraftintensiv og kan resultere i uønskede genetiske eller epigenetiske ændringer34,35. For det andet indeholder T0 linjer stadig en kopi af t-DNA, herunder antibiotikaresistens kassetten. Dette begrænser antallet af mulige re-transformationer, da der kræves forskellige markerings markører for hver re-transformation. I øjeblikket har vi kun testet transformation ved hjælp af kanamycin eller hygromycin udvælgelse (data ikke vist). Desuden komplicerer tilstedeværelsen af Cas9-kodnings sekvensen og sgRNAs i T0 transgene Lines komplementerings undersøgelser. Komplementerings analyser er mulige, men kræver, at sgRNA-målstedet (-erne) muterer som sådan, at genredigering af komplementerings konstruktionen forhindres. For det tredje er en ulempe ved at arbejde med T0 linjer, at crispr/Cas9 mutanter kan være chimerisk. For at forhindre fænotypisk analyse af chimeriske mutante linjer anbefaler vi at gentage genotypebestemmelse analysen efter in vitro-formering på mindst 3 forskellige skud. Selv om antallet af kimerisk mutanter opnået ved hjælp af den protokol, der er beskrevet her, er begrænset, er de lejlighedsvis observeret10. For at overvinde begrænsningerne ved at arbejde med T0 linjer, kan P. andersonii mutant linjer formes generativt. P. andersonii træer er Tvebo og vind-Bestøvlede2. Det betyder, at hver transgene linje skal manipuleres som sådan, at de mandlige og kvindelige blomster produceres på en enkelt person, og efterfølgende dyrkes som sådan, at krydsbestøvning ikke forekommer. Da P. andersonii er et hurtigtvoksende træ, kræver det en betydelig mængde plads i et tropisk drivhus (28 °c, ~ 85% relativ luftfugtighed). Selv om det er teknisk muligt, er generativ formering af P. andersonii transgene linjer derfor logistisk udfordrende.

I afsnittet protokol, vi beskrev 3 metoder til nodulation af P. andersonii. Fordelen ved pladen og pose systemer er, at rødderne er let tilgængelige, hvilket kan tillade spot-inokulering af bakterier og efter knudedannelse over tid. Men pladesystemet er ganske arbejdskraftintensivt, hvilket gør det mindre velegnet til store nodulation eksperimenter. En ulempe ved pose systemet er, at det er vanskeligt at forhindre svampe kontaminering. Poser er ikke sterile, og derfor observeres svampevækst ofte på den øverste halvdel af posen. Men, dette påvirker ikke P. andersonii vækst, og derfor ikke interferere med nodulation assays. Desuden er pose systemet kun egnet til frøplanter. Trods flere forsøg, har vi været i stand til at dyrke plantlets opnået gennem in vitro-formering i poser.

Den P. andersonii reverse genetik pipeline beskrevet her tilbyder en væsentlig forbedring i forhold til den eksisterende a. rhizogenes-baserede root transformation metode11. Ved hjælp af de beskrevne procedurer kan stabile transgene linjer genereres effektivt og kan vedligeholdes via in vitro-formering. I modsætning hertil er A. rhizogenes transformation forbigående og resulterer kun i dannelsen af transgene rødder. Fordi hver transgene rod resultater fra en uafhængig transformation, A. rhizogenes transformation-baserede assays lider af betydelig fænotypiske variation. Denne variation er meget mindre i tilfælde af stabile linjer, selv om in vitro-formering også skaber en vis grad af variation. På grund af denne reducerede variation og det faktum, at flere plantlets kunne fænoskrives for hver stabil linje, er stabile linjer mere velegnede til kvantitative assays sammenlignet med A. rhizogenes-transformerede rødder. Desuden er den stabile transformation ikke afhænger af indførelsen af a. rhizogenes root inducerende locus (ROL), der påvirker den endogene hormon balance15. Derfor er stabile linjer bedre egnet til omvendt genetisk analyse af gener, der er involveret i hormon homøostase sammenlignet med A. rhizogenes-transformerede rødder. En mere generel fordel ved P. andersonii som forskningsmodel er, at det ikke oplevede en nylig hel genom duplikering (wgd). Bælgplanter papilionoideae subfamily, som omfatter modellen bælgfrugter M. truncatula og L. japonicus, samt Salicaceae (Order malpighiales), der omfatter modeltræet Populus Balsampoppel erfarne wgds ~ 65 millioner år siden36,37. Mange parallogous geneksemplarer som følge af disse wgd'er bevares i genomer af M. truncatula, L. japonicus og P. Balsampoppel37,38,39, som skaber redundans, der kan komplicere omvendte genetiske analyser. Da p. andersonii ikke oplevede en nylig wgd, omvendte genetiske analyser på P. andersonii kan være mindre påvirket af overflødig funktion af paralogous genkopier.

Tilsammen giver vi en detaljeret protokol for omvendt genetisk analyse i P. andersonii. Ved hjælp af denne protokol, enkelt mutant linjer kan genereres effektivt i en tidsramme på 2-3 måneder10. Denne protokol kan udvides til at skabe højere orden mutanter gennem multiplexing af sgrnas målretning forskellige gener samtidigt, som vist for andre plantearter40,41,42. Desuden er den stabile Transformations procedure, der er beskrevet her, ikke begrænset til CRISPR/Cas9-genmålretning, men kan også bruges til at introducere andre typer konstruktioner (f. eks. til promotor-reporter-assays, Ektopisk udtryk eller Trans- komplementering). Vi etablerede P. andersonii som en komparativ forskningsmodel til at studere gensidige symbioser med kvælstof bindingen rhizobia eller endomycorrhizal svampe. Men de protokoller, der er beskrevet her, indeholder også værktøjer til at studere andre aspekter af biologien i dette tropiske træ, såsom trædannelse, udvikling af biseksuelle blomster eller biosyntesen af Cannabaceae-specifikke sekundære metabolitter.

Acknowledgements

Forfatterne vil gerne anerkende Mark youles, Sophien Kamoun og Sylvestre Marillonnet for at gøre Golden Gate klonings dele tilgængelige via Addgene-databasen. Derudover vil vi gerne takke E. James, P. Hadobas og T. J. Higgens for p. andersonii Seeds. Dette arbejde blev støttet af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (NWO-VICI Grant 865.13.001; NWO-åben konkurrence tilskud 819.01.007) og ministeriet for forskning, teknologi og videregående uddannelse i Republikken Indonesien (RISET-PRO Grant 8245-ID).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Sigma-AldrichN0640NAA
Duchefa BiochemieM1503.0250MES
Sigma-AldrichD134406Acetosyringone
Duchefa BiochemieX1402.1000X-Gal
Merck101236For nucleic acid electrophoresis gel
--Pouches box material, hangers
Merck101188NH4NO3
Sigma-AldrichB3408-1GBAP
Merck100156H3BO3
Thermo-FisherER1011Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly
Thermo-Fisher15561020Used in Golden Gate cloning assembly
Merck137101CaCl2·2H2O
Duchefa BiochemieC0111.0025C16H16N5O7S2Na
Thermo-FisherK1231Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure
AgronutritionAP2011Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay
Merck102790CuSO4·5H2O
Duchefa BiochemieD1004.1000Used for plant tissue culture agar-based medium
Merck105101K2HPO4
VWR Chemicals20302.293Na2·EDTA
Duchefa BiochemieM0803.1000C6H14O6
Thermo-FisherER0291Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly
Merck100983C2H5OH
VWR ChemicalsBDH9232-500GEDTA
Sigma-AldrichZ377600-1PAKCellophane membrane
Biomatters, Ltd.R9 or higherBioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs
Mega International-Technical information at https://mega-international.com/tech-info/
Sigma-Aldrich65882Used for fixating nodule tissues
VWR Chemicals24385.295-
Vink219341Pouches box material, bottom part
Leica Biosystems14702218311Used as a template for plastic embedding
Merck100317HCl
Sigma-AldrichI5386-1GIBA
Merck103862C6H5FeO7
Merck103965FeSO4O·7H2O
Duchefa BiochemieI1401.0005IPTG
Duchefa BiochemieK0126.0010 
Sigma-AldrichL2000 
Merck105886MgSO4O·7H2O
Merck105934MnCl2·4H2O
Merck102786MnSO4O
Duchefa BiochemieM1002.1000Used for bacterial culture agar-based medium
Manutan92007687Pouches material
Paraxisdienst130774Elastic sealing foil
Pull RhenenAgra-Perlite No.3Used as growing substrate in pots for nodulation assay
VWR Chemicals391-0581Used as container for cellophane membranes
Thermo-FisherF130WHFor genotyping transgenic lines
Addgene 50337Level 0 terminator, 3'UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus)
Addgene 48017End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor
Addgene 48018End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor
Addgene 48001Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation
Addgene 48007Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation
Addgene 50268Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5'UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus)
Addgene 46966Used for designing CRISPR/Cas9 module
Addgene 46968Used for designing CRISPR/Cas9 module
Addgene 50334Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette
Topzeven-Used as filters for washing spore suspension
Sigma-Aldrich8.17003PEG400
Duchefa BiochemieE1674.0001Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings
Merck104871KH2PO4
Merck105033KOH
Merck105153K2SO4O
Van Leusden b.v.-Used as growing substrate for mychorrhization assay
Duchefa BiochemieS0225.0050SH-basal salt medium
Duchefa BiochemieS0411.0250SH-vitamin mixture
Lehle SeedsVIS-02Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation
Merck137017NaCl
VWR Chemicals89230-072C6H11NaO7
Merck106521Na2MoO4·2H2O
Merck106574Na2HPO4·7H2O
Merck567549NaH2PO4·H2O
Sigma-Aldrich239313Na2SO4O
Duchefa BiochemieS0809.5000C12H22O11
Thermo-FisherB69Used in Golden Gate cloning assembly
Thermo-FisherEL0013Used in Golden Gate cloning assembly
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64708806Methyl methacrylate-based resin powder
Kulzer-Mitsui Chemicals Group64709003HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution
Kulzer-Mitsui Chemicals Group66022678Methyl methacrylate-based resin solution
Merck1159300025 
Acros189350250 
VWR Chemicals663684BPolysorbate 20
Stout Perspex-pouches box material, lid
Duchefa BiochemieY1333.1000 
Merck108816ZnCl2
Alfa Aesar33399ZnSO4O·7H2O

References

  1. Clason, E. W. THE VEGETATION OF THE UPPER-BADAK REGION OF MOUNT KELUT (EAST JAVA). Bulletin du Jardin Botanique de Buitenzorg. Serie III, 509-518 (1936).
  2. Soepadmo, E. Ulmaceae. Flora Malesiana-Series 1, Spermatophyta. 8, 31-76 (1974).
  3. Becking, J. H. The Rhizobium symbiosis of the nonlegume Parasponia. Biological Nitrogen Fixation. , 497-559 (1992).
  4. Oldroyd, G. E. D. Speak, friend, and enter: signalling systems that promote beneficial symbiotic associations in plants. Nature Reviews Microbiology. 11, 252-263 (2013).
  5. Gutjahr, C., Parniske, M. Cell and developmental biology of arbuscular mycorrhiza symbiosis. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 29, 593-617 (2013).
  6. van Velzen, R., et al. Comparative genomics of the nonlegume Parasponia reveals insights into evolution of nitrogen-fixing rhizobium symbioses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, E4700-E4709 (2018).
  7. van Velzen, R., Doyle, J. J., Geurts, R. A Resurrected Scenario: Single Gain and Massive Loss of Nitrogen-Fixing Nodulation. Trends in Plant Science. 24, 49-57 (2019).
  8. Griesmann, M., et al. Phylogenomics reveals multiple losses of the nitrogen-fixing root nodule symbiosis. Science. 1743, eaat1743 (2018).
  9. Becking, J. H. Root-Nodule Symbiosis Between Rhizobium And Parasponia (Ulmaceae). Plant and Soil. 51, 289-296 (1979).
  10. van Zeijl, A., et al. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Four Putative Symbiosis Genes of the Tropical Tree Parasponia andersonii Reveals Novel Phenotypes. Frontiers in Plant Science. 9, 284 (2018).
  11. Cao, Q., et al. Efficiency of Agrobacterium rhizogenes–mediated root transformation of Parasponia and Trema is temperature dependent. Plant Growth Regulation. 68, 459-465 (2012).
  12. Limpens, E., et al. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. Journal of Experimental Botany. 55, 983-992 (2004).
  13. Boisson-Dernier, A., et al. Agrobacterium rhizogenes-Transformed Roots of Medicago truncatula for the Study of Nitrogen-Fixing and Endomycorrhizal Symbiotic Associations. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14, 695-700 (2001).
  14. Kumagai, H., Kouchi, H. Gene Silencing by Expression of Hairpin RNA in Lotus japonicus Roots and Root Nodules. Molecular Plant-Microbe Interactions. 16, 663-668 (2003).
  15. Nilsson, O., Olsson, O. Getting to the root: The role of the Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physiologia Plantarum. 100, 463-473 (1997).
  16. Davey, M. R., et al. Effective Nodulation of Micro-Propagated Shoots of the Non-Legume Parasponia andersonii by Bradyrhizobium. Journal of Experimental Botany. 44, 863-867 (1993).
  17. Webster, G., Poulton, P. R., Cocking, E. C., Davey, M. R. The nodulation of micro-propagated plants of Parasponia andersonii by tropical legume rhizobia. Journal of Experimental Botany. 46, 1131-1137 (1995).
  18. Op den Camp, R., et al. LysM-type mycorrhizal receptor recruited for rhizobium symbiosis in nonlegume Parasponia. Science. 331, 909-912 (2011).
  19. Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. A Modular Cloning System for Standardized Assembly of Multigene Constructs. PLOS ONE. 6, e16765 (2011).
  20. Nekrasov, V., Staskawicz, B. J., Weigel, D., Jones, J. D. G., Kamoun, S. Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 31, 691-693 (2013).
  21. Bertani, G. Studies On Lysogenesis. I. The Mode Of Phage Liberation By Lysogenic Escherichia Coli. Journal of Bacteriology. 62, 293-300 (1951).
  22. Engler, C., et al. A Golden Gate modular cloning toolbox for plants. ACS Synthetic Biology. 3, 839-843 (2014).
  23. Fauser, F., Schiml, S., Puchta, H. Both CRISPR/Cas-based nucleases and nickases can be used efficiently for genome engineering in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 79, 348-359 (2014).
  24. Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA Transformation-Competent Arabidopsis Genomic Library in Agrobacterium. Biotechnology. 9, 963-967 (1991).
  25. Op den Camp, R. H. M., et al. N Nonlegume Parasponia andersonii Deploys A Broad Rhizobium Host Range Strategy Resulting in Largely Variable Symbiotic Effectivenes. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25, 954-963 (2012).
  26. Graham, P. H., Viteri, S. E., Mackie, F., Vargas, A. T., Palacios, A. Variation in acid soil tolerance among strains of Rhizobium phaseoli. Field Crops Research. 5, 121-128 (1982).
  27. Martinez-Romero, E., et al. Rhizobium tropici, A Novel Species Nodulating Phaseolus vulgaris L. Beans and Leucaena sp. Trees. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 41, 417-421 (1991).
  28. Felten, J., et al. The Ectomycorrhizal Fungus Laccaria bicolor Stimulates Lateral Root Formation in Poplar and Arabidopsis through Auxin Transport and Signaling. Plant Physiology. 151, 1991-2005 (1991).
  29. Trouvelot, A., Kough, J. L., Gianinazzi-Pearson, V. Mesure du taux de mycorhization VA d’un systeme radiculaire. Recherche de methods d’estimation ayant une signification fonctionnelle. Aspects Physiologiques et Genetiques des Mycorhizes. , 217-221 (1986).
  30. Schenk, R. U., Hildebrandt, A. C. Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures. Canadian Journal of Botany. 50, 199-204 (1972).
  31. Becking, J. H. The Parasponia parviflora - Rhizobium symbiosis. Host specificity, growth and nitrogen fixation under various conditions. Plant and Soil. 75, 309-342 (1983).
  32. Hoagland, D. R., Arnon Revised, D. I., Arnon, D. I. The Water-Culture Method for Growing Plants without Soil. Circular California Agricultural Experiment Station. 347, 1-32 (1950).
  33. Wang, K. . Methods in Molecular Biology: Agrobacterium Protocols. 1, (2015).
  34. Smulders, M. J. M., de Klerk, G. J. Epigenetics in plant tissue culture. Plant Growth Regulation. 63, 137-146 (2011).
  35. Larkin, P. J., Scowcroft, W. R. Somaclonal variation — a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied Genetics. 60, 197-214 (1981).
  36. Cannon, S. B., et al. Legume genome evolution viewed through the Medicago truncatula and Lotus japonicus genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 14959-14964 (2006).
  37. Tuskan, G. A., et al. The Genome of Black Cottonwood, Populus trichocarpa (Torr. & Gray). Science. 313, 1596-1604 (2006).
  38. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520 (2011).
  39. Sato, S., et al. Genome Structure of the Legume, Lotus japonicus. DNA Research. 15, 227-239 (2008).
  40. Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biology. 14, 327 (2014).
  41. Lowder, L. G., et al. A CRISPR/Cas9 Toolbox for Multiplexed Plant Genome Editing and Transcriptional Regulation. Plant Physiology. 169, 971 (2015).
  42. van Zeijl, A. . Dissecting Hormonal Pathways in Nitrogen-Fixing Rhizobium Symbioses. , (2017).

Explore More Articles

GenetikParasponia andersoniicannabaceaetrtrAgrobacterium tumefaciensstabil transformationcrispr Cas9genomredigeringnodulationRhizobiummykorrhization

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved