Field Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Resource-Limited Settings with Further Molecular Applications

Summary

Vi præsenterer en komplet protokol for postmortem diagnose af dyr rabies under feltbetingelser ved hjælp af en hurtig immunkromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernen biopsi prøveudtagning til endelig fortolkning. Vi beskriver også yderligere applikationer ved hjælp af enheden til molekylær analyse og viral genotypering.

Abstract

Funktionelle rabiesovervågningssystemer er afgørende for at tilvejebringe pålidelige data og øge det politiske engagement, der er nødvendigt for sygdomsbekæmpelse. Hidtil skal dyr, der mistænkes for at være rabiespositive, underkastes en postmortem-bekræftelse ved hjælp af klassiske eller molekylære laboratoriemetoder. De fleste endemiske områder ligger imidlertid i lav- og mellemindkomstlande, hvor diagnosticering af rabies af dyr er begrænset til centrale veterinærlaboratorier. Dårlig adgang til overvågningsinfrastruktur fører til alvorlig underrapportering af sygdomme fra fjerntliggende områder. Der er for nylig udviklet adskillige diagnostiske protokoller, der kræver lav teknisk ekspertise, hvilket giver mulighed for at etablere rabiesdiagnose i decentraliserede laboratorier. Vi præsenterer her en komplet protokol for feltpostmortemdiagnose af husdyr rabies ved hjælp af en hurtig immunkromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernebiopsiprøvetagning til den endelige fortolkning. Vi fuldender protokollen ved at beskrive en yderligere brug af enheden til molekylær analyse og viral genolyping. RIDT registrerer nemt rabiesvirus og andre lyssavira i hjerneprøver. Princippet om sådanne test er enkelt: hjernemateriale påføres på en teststrip, hvor guldkonjugerede antistoffer binder sig specifikt til rabiesantigener. Antigen-antistofkomplekserne binder sig yderligere til faste antistoffer på testlinjen, hvilket resulterer i en klart synlig lilla linje. Virussen inaktiveres i teststrippen, men viralt RNA kan efterfølgende ekstraheres. Dette gør det muligt for teststrippen, snarere end den infektiøse hjerneprøve, at blive sikkert og nemt sendt til et udstyret laboratorium til bekræftelse og molekylær typning. Baseret på en ændring af producentens protokol, fandt vi øget test følsomhed, nå 98% i forhold til guld standard referencemetode, den direkte immunofluorescens antistof test. Fordelene ved testen er talrige: hurtig, nem at bruge, lave omkostninger og ingen krav til laboratorieinfrastruktur, såsom mikroskopi eller koldkæde overholdelse. RIDT'er er et nyttigt alternativ til områder, hvor der ikke findes referencediagnosticeringsmetoder.

Introduction

Hunde rabies er den vigtigste årsag til menneskers rabies, globalt ansvarlig for ca. 59.000 dødsfald om året, næsten alle forekommer i lav- og mellemindkomstlande (LMICs) i Asien og Afrika¹. Det vigtigste etikologiske middel er en neurotropisk hunde-associeret klassisk rabiesvirus (RABV, familie Rhabdoviridae, slægten Lyssavirus, arter Rabies lyssavirus). Andre rabiesrelaterede lyssavira, der for det meste cirkulerer hos flagermusarter, forårsager imidlertid også sygdom^2,3. I de berørte regioner hæmmes sygdomsovervågning og -bekæmpelse ofte af et lavt politisk engagement , sandsynligvis på grund af mangel på pålidelige data^4,5,6. En af grundene til sygdomsunderrapportering er manglen på laboratoriediagnose, til dels på grund af begrænset adgang til udstyrede laboratorier og uddannet personale samt vanskelighederne ved forsendelse af enhederne. Laboratoriediagnose er nødvendig for at bekræfte rabiestilfælde og giver desuden mulighed for genetisk karakterisering af de involverede stammer, hvilket giver indsigt i virusoverførsel på regionalt niveau^4,5,7.

De nuværende guldstandarder for diagnosticering af rabies efter døden, som er godkendt af både Verdenssundhedsorganisationen (WHO) og Verdensorganisationen for Dyresundhed (OIE), er den direkte fluorescerende antistoftest (DFAT), den direkte hurtige immunhistokemitest (DRIT) og molekylære metoder (f.eks. omvendt transskriptionspolymerasekædereaktion (RT-PCR))^4,8. Korrekt anvendelse i lMIC'er er dog fortsat begrænset på grund af utilstrækkelige laboratoriefaciliteter med inkonsekvent strømforsyning, uoverbørlig prøvetransport og mangel på et kvalitetsstyringssystem. Da diagnosticering af rabies ved dyr typisk kun udføres på centrale veterinærlaboratorier i læger, afspejler de eksisterende overvågningsdata hovedsagelig rabiessituationen i byområder.

Nyligt udviklede diagnosealternativer med lavteknologi giver mulighed for at etablere rabiesdiagnose i fjerntliggende områder og decentraliserede rabieslaboratorier^4,8,9. Den hurtige immunkromatografiske diagnostiske test (RIDT) er en lateral flowtest baseret på immunkromatografi med guldkonjugerede detektorantistoffer og er et meget lovende rabiesdiagnostikværktøj^10,11,12,13. Princippet er enkelt: Efter fortynding blandes hjernematerialet i den medfølgende buffer, og der påføres et par dråber på teststrippen, hvor guldkonjugerede monoklonale antistoffer binder specifikt sig til rabiesantigener, hovedsagelig nukleoproteiner (Figur 1). Antigen-antistofkomplekserne gennemgår derefter lateral flowmigration, der bindes ved testlinjen (T-line) til faste antistoffer mod rabiesantigener, hvilket resulterer i en klart synlig lilla linje. De resterende guldkonjugerede antistoffer, der ikke er bundet til rabiesantigener, fortsætter med at migrere og fastgøres til membranen gennem yderligere målretningsantistoffer, hvilket resulterer i en klart synlig lilla kontrollinje (C-line).

Den ene trin, lave omkostninger metode er hurtig, ekstremt let og kræver ikke dyrt udstyr eller særlige opbevaringsforhold. Ved ændring af fabrikantens protokol for at eliminere fortyndingstrinnet er næsten alt udstyr og reagenser, der kræves for at udføre testen, inkluderet i pakke¹⁴. Resultatet aflæses efter 5-10 minutter uden mikroskop. Dette er en stor fordel i forhold til DFAT-testen, som kræver et fluorescensmikroskop og immunfluorescenskonjugat sammen med køletransport og prøveopbevaring. Selv DRIT-testen, som kan udføres ved hjælp af et let mikroskop, kræver en kontinuerlig kølekæde til opbevaring af anti-rabies antistoffer, som heller ikke er kommercielt tilgængelige. I forhold til DRIT kræver RIDT ingen giftige kemikalier, en særlig fordel i lande, hvor bortskaffelse af affald er dårligt reguleret. Den hurtige test er mindre tidskrævende med meget lettere fortolkning i forhold til guldstandardtestene DFAT og DRIT. Dette giver mulighed for on-site test af personale med begrænset teknisk ekspertise.

På grundlag af disse testegenskaber bliver det muligt at foretage hurtig diagnosticering af mistænkte dyr i fjerntliggende områder, hvilket gør det lettere at implementere profylakse efter eksponering (PEP) for eksponerede personer så hurtigt som muligt. Desuden er fjerntransport af rabiesprøver ikke nødvendig, hvilket resulterer i bedre prøvekvalitet på testtidspunktet. De resultater, der er opnået ved RIDT-testene, bør dog på nuværende tidspunkt bekræftes ved hjælp af en referencediagnostisk test som DFAT eller DRIT.

RIDT-teknikker til påvisning af RABV og andre lyssavira er blevet evalueret. En af de første undersøgelser blev udført af koreanske forskere i 2007¹⁰. Sammenlignet med DFAT-metoden viste RIDT i 51 dyreprøver og 4 RABV-isolater en følsomhed og specificitet på henholdsvis 91,7 % og 100 %. Disse resultater blev senere bekræftet med 110 animalske hjerneprøver fra Korea, med følsomhed og specificitet, sammenlignet med DFAT, på 95% og 98,9%, henholdsvis¹⁵. For nylig vurderede andre undersøgelser denne RIDT's ydeevne ved hjælp af virusisolater og/eller inficerede hjerneprøver fra forskellige dyr med forskellig geografisk oprindelse. Et panel på 21 prøver, herunder afrikansk RABV og andre afrikanske lyssavira (Duvenhage virus (DUVV), Lagos bat virus (LBV) og Mokola virus (MOKV)), blev opdaget med succes, med følsomhed på 100% i forhold til DFAT¹⁶. Lignende høj følsomhed (96,5%) og specificitet (100 %) fra et panel på 115 hjerneprøver fra Etiopien^17. En anden undersøgelse evaluerede europæiske RABV-isolater, to andre europæiske lyssavira (europæisk batlysavirus type 1 (EBLV-1) og type 2 (EBLV-2)) og det australske batlysavirus (ABLV)¹⁸. Baseret på analyse af 172 dyrehjernprøver havde RIDT-sættet 88,3 % følsomhed og 100 % specificitet sammenlignet med DFAT, og de tre rabiesrelaterede lyssavira blev med succes opdaget. I denne undersøgelse kom nogle af de falske negative resultater fra hjerneprøver gemt i glycerol buffer, hvilket tyder på, at forkert glycerol fjernelse påvirket kapillær flow eller antistof bindende. En nylig analyse af 43 kliniske prøver fra australske flagermus bekræftede tidligere testresultater, med fuldstændig konkordans til DFAT¹⁹. Der blev udført to undersøgelser i Indien ved hjælp af RIDT på et begrænset antal kliniske prøver (11 og 34 prøver). Sammenlignet med DFAT var følsomheden mellem 85,7 % og 91,7^%,og specificiteten var 100 %²⁰,²¹. En anden evaluering af dette kit ved hjælp af 80 animalske hjerneprøver fra Afrika, Europa og Mellemøsten opnået fuldstændig konkordans med DFAT for specificitet (100%) men en højere følsomhed (96,9%) i forhold til de foregående undersøgelser^22. I en nylig sammenligning mellem laboratorier af denne RIDT udført i 22 forskellige laboratorier ved hjælp af et panel på 10 prøver, samlede konkordans var 99,5%²³.

Kun én nylig multicentrisk undersøgelse viste utilfredsstillende samlede RIDT-resultater²⁴. Prøver fra tre forskellige datasæt blev testet og gav variable følsomheds- og specificitetsværdier sammenlignet med DFAT. F.eks. gav følsomhed og specificitet opnået med det første panel (n=51) og det andet panel (n=31) af prøver fra forsøgsdemittede dyr, der alle blev testet i laboratorium A, en følsomhed på henholdsvis 16 % og 43 %, mens specificiteten var 100 % for begge. Omvendt gav resultaterne af det tredje panel (n=30) af kliniske feltprøver analyseret ved laboratorium B fuldstændig konkordans med resultaterne af DFAT, som blev yderligere næsten fuldstændig bekræftet af laboratorium A (85% følsomhed og 100% specificitet). Batch-til-batch-variation blev foreslået som en mulig forklaring på den svingende relativt lave følsomhed med RIDT²⁴.

Samtidig udførte en anden undersøgelse en lignende valideringsproces af ovennævnte RIDT, med en ændring af producenten anbefalede protokol¹⁴. Forfortyndingstrinnet (1:10) i PBS blev udeladt under klargøring af hjernematerialet. På grundlag af denne enklere modificerede protokol opnåede forfatterne følsomhed og specificitet på henholdsvis 95,3 % og 93,3 % sammenlignet med DFAT ved under laboratorieforhold at teste et datasæt på 73 animalske hjerneprøver, naturligt eller eksperimentelt inficeret med forskellige RABV-stammer. Undersøgelsen præsenterede den første evaluering af denne RIDT i marken (Tchad, Afrika). I 48 kliniske hjerneprøver var følsomhed og specificitet henholdsvis 94,4 % og 100 %. Uoverensstemmelserne mellem DFAT og RIDT skyldtes falske positive resultater med DFAT, bestemt efter bekræftelse med RT-PCR. Da disse resultater blev slettet, var der fuldstændig overensstemmelse, og det viste, at RIDT var mere pålidelig end DFAT under disse feltbetingelser¹⁴. Der blev ikke observeret nogen batch-til-batch-variation ved hjælp af den ændrede protokol. Da den ændrede protokol blev anvendt på et lille antal af de divergerende DFAT/ RIDT-prøver (n=8) i undersøgelsen af Eggerbauer et al.^24,blev alle fundet konsnative (100 % følsomhed).

En anden stor fordel ved RIDT er sekundær anvendelse til påvisning af viral RNA, der er fastgjort på strimlen ved hjælp af molekylære teknikker (såsom RT-PCR) og efterfølgende genotyping^14,24. Efter et ekstraktionstrin påviste Léchenne et al.¹⁴ viral RNA, der var fastgjort på Anigen-anordningens membran ved hjælp af RT-PCR med 86,3 % følsomhed i et panel på 51 prøver (herunder 18 prøver, der blev testet og afsendt fra Tchad ved omgivelsestemperatur). Efterfølgende genotypering var mulig i 93 % af de 14 testede prøver. Der blev anvendt en sekvensering af PCR-ampliconer på mindst 500 nukleotider i længden. Ud over RABV-isolater påviste testen fire andre lyssavirusarter, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 og Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), under en fuldt samstemmende international interlaboratorietest¹⁴. Følsomheden af viral RNA-detektion var endnu højere (100 %) i undersøgelsen af Eggerbauer et al., baseret på laboratorieprøver undersøgelse²⁴. Sidstnævnte undersøgelse viste også, at den buffer, der anvendes i RIDT kit inaktiveret virus. Derved kan enhederne nemt sendes ved omgivelsestemperatur uden specifikke biosikkerhedsforanstaltninger til referencelaboratorier, til molekylær bekræftelse og genolyping.

Baseret på de tidligere evalueringer giver RIDT-værktøjer mange fordele til brug i feltindstillinger, især når referencediagnosticeringsteknikkerne ikke er tilgængelige. Denne test har imidlertid også visse begrænsninger, navnlig lav følsomhed af antigendetektion^14,24. Testen gælder for prøver, der indeholder store mængder virale antigener, såsom hjerneprøver. Det er dog ikke hensigtsmæssigt for andre prøver såsom spyt eller andre kropsvæsker. En anden ulempe er omkostningerne ved enheden (omkring 5-10 euro i Europa), hvilket er billigere i forhold til omkostningerne ved at udføre DFAT, RT-PCR eller DRIT, men som stadig er høj for LMICs. Den fremtidige udvikling og validering af lignende RIDT'er fra andre virksomheder kan imidlertid føre til et prisfald. En undersøgelse rapporterede batch-til-batch variationer. Selv om det ikke er rapporteret af andre, bør der ikke desto mindre udføres streng kvalitetskontrol ved afprøvning af et nyt parti, som for alle reagenser, der anvendes i et kvalitetsstyringsmiljø. Brugen af den ændrede protokol blev ikke ændret, når der blev brugt forskellige batches¹⁴. Alle undtagen én undersøgelse viste, at RDIT's følsomhed var høj sammenlignet med DFAT (ca. 90-95 %). Da rabies altid er dødelig, anbefales det stadig kraftigt at bekræfte eventuelle negative resultater med RDIT ved hjælp af en referencediagnostiktest som DFAT, DRIT eller RT-PCR¹⁴.

I dette manuskript præsenterer vi en komplet protokol for felteftermorgendiagnosticering af husdyr rabies baseret på et eksempel på en kommercialiseret RIDT, fra hjerneprøve indsamling til anvendelse af en modificeret protokol i forhold til fabrikanten anbefalinger (som tidligere blev valideret¹⁴) og efterfølgende molekylær analyse. Denne protokol blev anvendt og valideret mange gange under feltbetingelser i Vest- og Centralafrika, hvor RIDT rutinemæssigt blev brugt til rabiesdiagnose sammen med DFAT-testen. Vi demonstrerer desuden en anden applikation til enheden, i laboratoriemiljøer, til udvinding og detektion ved hjælp af RT-PCR viral RNA fast på enheden.

Protocol

1. Prøvetagning via foramen magnum (occipital rute)²⁵

BEMÆRK: Denne teknik kan implementeres under laboratorieforhold eller i feltindstillinger. Prøverne skal forarbejdes så hurtigt som muligt efter det mistænkte dyrs død eller opbevares ved kølig temperatur (nedkølet eller frosset, hvis det er muligt) for at undgå nedbrydning, som kan påvirke resultaterne. I lighed med andre referenceteknikker baseret på lyssavirusantigendetektion såsom DFAT og DRIT bør nedbrudte prøver ikke testes, da det kan påvirke resultatet (risiko for falsk negativt resultat).

FORSIGTIG: Alle prøver bør betragtes som potentielt infektiøse. Sikkerhedsforskrifter og -procedurer bør følges nøje, selv i^{feltindstillingerne 4}. Brug især passende personlige værnemidler, herunder maske, briller, handsker og en laboratoriekittel. Brug passende desinfektionsmiddel til materiale og dekontaminering af prøver (f.eks. natriumhypochlorit med anbefalede fortyndinger fra producenten, 70 % alkohol - ethanol eller isopropanol, 1 % sæbeopløsning). Alt personale, der håndterer prøver, skal vaccineres mod rabies.

1. Fjern dyret hovedet med en kniv før den første halshvirvel (atlas ryghvirvel) for at få adgang til foramen magnum.
   BEMÆRK: For at minimere inficeret aerosol undgå at bruge en manuel sav eller lignende værktøj.
2. Opsaml hjernestamme (medulla oblongata) ved hjælp af en engangsplastpipette (Figur 2A),et drikkehalm (Figur 2B), en klemme (figur 2C) eller en pipette (forsynet med RIDT) (Figur 2D).
   BEMÆRK: Der skal lægges særlig vægt på indsamling af prøven, da det er et yderst vigtigt skridt for resultaternes pålidelighed. Ud over den tilhørende video, som viser på en enkel måde, hvordan man indsamler den del af hjernestammen af interesse, et træningstrin anbefales stærkt at sørge for at indsamle den korrekte anatomiske sektion.
3. Eventuelt og ud over hjernestammen (medulla oblongata), indsamle andre dele af hjernestammen eller hjernen (cerebellum, hippocampus, thalamus og cortex) ved samme occipital rute ved at skubbe og dreje plast pipetten eller halmen mod øjenhulen (Figur 3).
4. Hvis du bruger et strå eller en pipette, skal du forsigtigt presse den til at deponere hjerneprøven (0,5-2 g) i et rør til efterfølgende analyse og/eller biobanking.
   BEMÆRK: Prøveopbevaring i glycerol anbefales ikke, da det ser ud til at påvirke kapillærstrømmen eller antistofbindingstrinnet i RIDT¹⁸.

2. Gennemførelse af den ændrede RIDT-protokol¹⁴

BEMÆRK: Denne ændring udelader et fortyndingstrin (1:10) i PBS, som angivet i producentprotokollen (alle versioner), og kan implementeres under laboratorie- eller feltindstillinger.

1. Podepinden/dropperen anvendes til at opsamle, hvad der svarer til en halv jordnødde- eller ært (0,1-0,5 g) hjernemateriale, og anbringes i bufferprøvens rør.
   BEMÆRK: For den ændrede protokol er alle reagenser/forbrugsstoffer inkluderet i sættet (der kræves ingen PBS eller yderligere rør) (Figur 4). Dokumenter pakkekassens batchnummer, og kontroller udløbsdatoens gyldighed.
2. Knus forsigtigt hjernematerialet direkte i røret med podepinden eller dropperen i ca. 30 s, indtil der opnås en homogen suspension.
   BEMÆRK: Bufferreaktionen inaktiverer virussets infektivitet under betingelserne i fabrikantens protokol²⁴.
3. Ved hjælp af dropperen deponeres fire dråber (ca. 100 μL) af suspensionen i prøveindgangen på testanordningen.
4. Vent på fuldstændig prøveoverførsel (1-5 min),før testenheden læses. Migrationen bør starte hurtigt efter deponering af prøven (1-5 min).
5. I tilfælde af forsinkelse (på grund af høj viskositetsaffjedring) eller for at fremskynde starten af migrationen, forsigtigt ridse bunden af depositum site af enheden med dropper (1-5 gange) og i sidste ende tilføje 1-2 flere dråber. Migrationen bør påbegyndes umiddelbart derefter.
6. Testresultatet læses i registreringsvinduet efter 5-10 min og højst 20 min efter afslutningen af overflytningen.
7. Fortolke resultatet baseret på tilstedeværelse eller fravær af kontrollinjen (C-line) og testlinjen (T-line) (lilla linjer) i registreringsvinduet i henhold til figur 5. Prøven er positiv, når to linjer er synlige (figur 5A), negativ, hvis kun C-linjen er til stede ( figur5B) og ugyldig, hvis kun T-linjen er til stede, eller hvis ingen linjer er synlige ( figur5C).
   BEMÆRK: Ugyldige resultater skal gentages mindst én gang. Andre teknikker bør udføres, hvis resultaterne forbliver ugyldige. Negative resultater opnået med RIDT skal efterfølgende bekræftes ved hjælp af en guldstandardreferencemetode som DFAT, DRIT og molekylære metoder (polymerasekædereaktion eller PCR). Selv om følsomheden af denne test er høj (se repræsentative resultater), er det ikke 100%.
8. Opbevar brugte enheder ved stuetemperatur eller opbevares/fryses, når det er muligt, til efterfølgende molekylær analyse (se afsnit 4). Den resterende prøvesuspension fryses ved -20 °C/-80 °C i bufferrøret for om nødvendigt at gentage testen eller til efterfølgende molekylær analyse.

3. RNA-ekstraktion og detektion foretaget af RT-qPCR fra RIDT-enheden

BEMÆRK: Dette trin kan kun gennemføres under laboratorieforhold med tilpasset miljø og egnet udstyr til molekylær diagnose. Det kan gøres kort efter RIDT-testen eller med tilbagevirkende kraft på arkiverede RIDT-enheder, der opbevares ved stuetemperatur (15-30 °C), nedkølet eller frosset.

1. RNA-ekstraktion
   BEMÆRK: For at overvåge ekstraktionstrinnet anbefales det at anvende en intern betjeningsanitet, der kan være et endogent mRNA (f.eks. ß-actin) eller en udefrakomment kontrol (såsom eGFP syntetisk RNA), der er direkte tilsat prøven i de første trin af ekstraktionen^26,27.
   1. Åbn enheden forsigtigt, og fjern filterpapiret.
   2. Prøvens aflejringsområde hældes, og det anbringes i et rør indeholdende 1 ml Tri-Reagens LS. Inkuber ved RT i 1 time med blid regelmæssig manuel omrøring.
   3. Udfør ekstraktionen i overensstemmelse med fabrikantens anbefalinger, som tidligere beskrevet²⁷. På dette trin kan den eksogene interne kontrol tilføjes.
   4. Under processen tilsættes 2 μL glykogen for at lette udfældningen af RNA i henhold til fabrikantens anbefalinger.
   5. Det endelige volumen for RNA-resuspension justeres i nukleasefrit vand med et volumen på 50 μL, der normalt anvendes.
      BEMÆRK: Ved afslutningen af centrifugeringstrinnet for vandig og organisk faseadskillelse (efter tilsætning af 200 μL chloroform i Tri-Reagens LS) vil membranstykket fra enheden være i bunden af røret og ikke forstyrre indsamlingen af den øvre vandige fase. Alternativt kan andre nemme og hurtige protokoller anvendes, for eksempel ved hjælp af fenolbaserede reagenser og silicamembraner²⁸.
2. Detektion ved RT-qPCR²⁶
   BEMÆRK: Påvisning af potentiel viral RNA til stede i ekstraherede prøver kan ske ved hjælp af forskellige molekylære teknikker, såsom reverse-transskription PCR, konventionelle (endepunkt) eller realtid PCR (qPCR). Flere metoder er tilgængelige, såsom konventionelle RT-PCR^27,,29 eller RT-qPCR^26,30 rettet mod den virale nukleoprotein eller polymerase genet. Et eksempel vil blive præsenteret nedenfor baseret på en dobbelt kombineret pan-lyssavirus RT-qPCR rettet mod en bevaret region blandt den virale polymerase. Denne RT-qPCR-teknik forbinder to forskellige RT-qPCR: den ene baseret på TaqMan-sondeteknologien (pan-RABV RT-qPCR) og den anden ved hjælp af SyBR Green-detektionen (pan-lyssa RT-qPCR). Desuden foretages detektering af en udefrakommende intern kontrol (eGFP RNA), der er direkte tilsat under ekstraktionsprocessen, af en specifik TaqMan-sondebaseret RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Omhyggelig validering på stedet af de molekylære teknikker, der er udvalgt til påvisning af viralt RNA, er især vigtigt at kontrollere, at primere og sonder til RT-PCR i realtid er tilpasset til påvisning af de stammer, der cirkulerer i området af interesse⁴.
   1. RNA-prøven fortyndes til 1:10 i nukleasefrit vand. Hver RNA-prøve testes i to eksemplarer ved hjælp af en 96-brønds reaktionsplade eller andre formater. Brug positive og negative kontroller for hver analyse og test mindst i to eksemplarer.
   2. Den vigtigste mixreaktionsopløsning til de tre forskellige RT-qPCR-analyser i henhold til tabel 1og med de primere/sonder , der er angivet i tabel 2.
   3. Der tilsættes 5 μL fortyndede RNA-prøver og 15 μL masterblanding til hver af de tre forskellige analyser. Den pan-RABV RT-qPCR-analyse og eGFP RT-qPCR-analysen kan cykle i samme plade.
   4. De forskellige analyser anvendes efter de termiske cykelforhold, der er angivet i tabel 3. Hvis der kun findes én PCR-termisk cycler, skal du starte med pan-RABV RT-qPCR og holde pladen til pan-lyssa RT-qPCR ved 4 °C indtil udgangen af pan-RABV RT-qPCR.
   5. De opnåede resultater analyseres med de tre analyser i henhold til tabel 4.

4. Genootyping efter RNA-ekstraktion fra RIDT-enheden

1. Omvendt transskription RT^27,29
   1. Der forebesætning af en masterblanding med 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 tilfældige primere (200 μg/μL) og 2 μL nukleasefrit vand i et endeligt volumen på 10 μL.
   2. Inkuber ved 65 °C i 10 min i en varmeblok og opbevares derefter på is.
   3. Forbered en masterblanding med 6 μL 5x First-Strand Buffer, 2 μL af 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) hævet transkription, 2 μL (80 U) RNasin, 2 μL dNTP-blanding (10 μM) og komplet med nukleasefrit vand for at opnå et endeligt volumen på 20 μL for hver prøve.
   4. Master mix (20 μL) tilsættes prøven (10 μL) (sidste volumen på 30 μL) og inkuberes ved 42 °C i 90 min i en varmeblok.
   5. Fortsæt til næste trin med PCR-forstærkning eller opbevar cDNA ved -20 °C.
2. Konventionel PCR^27,29,31
   BEMÆRK: Forskellige teknikker til konventionel PCR er tilgængelige for genolyping. To præsenteres, både hemi-indlejret PCR, rettet mod en del af nukleoprotein eller en del af det virale protein i lyssavirus. Protokollen er den samme for hver af disse analyser, bortset fra primere og cykelforhold. Positive (positive RNA) og negative (negative cDNA og/eller nukleasefrit vand) bør indgå i hver serie og hver runde AF PCR.
   1. Forbered hver prøve i en 0,2 ml mikrorør en master mix reaktion løsning til det første PCR trin. Denne blanding indeholder 5 μL 10x NH4 Reaktionsbuffer, 2,5 μL MgCl_2-opløsning (50 mM), 1 μL dNTP Mix (10 μM), 1 μL af hver primer (10 μM), 0,2 μL (1 U) Biotaq DNA polymerase og 37,3 μL nukleasefrit vand (slutvolumen på 48 μL). Primere er angivet i tabel 5.
   2. Der tilsættes 2 μL cDNA i hvert rør og en cyklus på en separat konventionel PCR-termisk cycler for hver analyse i henhold til tabel 6.
   3. Der forbered en anden master mix reaktionsopløsning, der er identisk med den foregående med anvendelse af de relevante primere (Tabel 5) til den hemi-indlejrede PCR-reaktion.
   4. Der tilsættes 2 μL af det første runde PCR-produkt og -cyklus på en konventionel PCR-termisk cycler ved hjælp af de cykelparametre, der er angivet i tabel 6.
   5. Visualiser de forskellige PCR-produkter (første og anden runde PCR) efter at have lagt dem på en 1% agarose gel (100 ml Tris-aceta EDTA buffer 1x - TAE 1x) med ethidium bromid (endelig koncentration omkring 0,01%) og køre gelen i løbet af 30 min ved 120 V. Der observeres et positivt PCR-resultat i form af et lyst bånd af den forventede størrelse (tabel 5).
3. Sanger rækkefølge
   1. Udfør en Sanger sekvensering af ampliconer opnået med pan-lyssavirus hemi-indlejret PCR og fuldføre genotyping analyse.

Discussion

RIDT er en enkel, hurtig og billig metode til postmortem rabies diagnose og et lovende felt alternativ til laboratorietest. Anvendelsen af en sådan test, især for decentraliserede områder i lav- og mellemindkomstlande, vil forbedre forståelsen af forekomsten af rabiesvirus og overførsel på lokalt og potentielt nationalt plan. Når det kombineres med den hurtige hjerneprøve indsamling metode (uden fuld obduktion), en stor fordel er, at testen kan udføres helt i marken indstilling, væk fra laboratoriefaciliteter. Hjerneprøver indsamlet via foramen magnum kan bruges til test, og derfor er det ikke nødvendigt helt at åbne dyrets kranium. Testen er enkel at udføre og fortolke og er særlig velegnet til feltovervågning¹⁴. Andre fordele ved RIDT i forhold til DFAT eller DRIT er ikke behov for positive og negative kontroller og kit opbevaring ved stuetemperatur. Desuden kræver den ændrede protokol, hvor fortyndingstrinnet (1:10) i PBS udelades, ikke ekstra reagenser for at udføre testen og forenkler proceduren yderligere under feltbetingelser.

Et centralt punkt er kvaliteten af hjerneprøverne. Prøverne udtages og testes så hurtigt som muligt efter det mistænkte dyrs død eller opbevares ved kølig temperatur inden prøvningen for at undgå nedbrydning. Dekokomprotesterede prøver bør ikke testes, da det kan påvirke resultatet (risiko for falsk negativt resultat). Selv om der endnu ikke foreligger data om tab af følsomhed af RIDT over tid for hjerneprøver, antager vi, at det ligner i forhold til DFAT-test^32. Tiden mellem dyrets død og udførelsen af testen kan dog reduceres, da testen kan udføres hurtigt og direkte i marken. Der er således generelt en lavere risiko for nedbrudte prøver.

Et andet vigtigt trin i protokollen er overførsel af prøvesuspension. Migrationen bør starte umiddelbart efter deponering af prøven (1-5 min). En høj viskositet af suspensionen kan derfor have en negativ indflydelse på migrationen. Forsigtigt skrabe bunden af enheden depositum site med dropper og tilføje 1-2 flere dråber ofte løser dette problem, og migrationen begynder umiddelbart efter.

De fleste RIDT-test, der blev udført i afrikanske laboratorier (Tchad, Elfenbenskysten og Mali), blev udført ved omgivelsestemperatur, som kan overstige 30 °C, mens det temperaturområde, der anbefales af fabrikanten, er 15 °C - 30 °C. Selv om vi ikke identificerede nogen indvirkning af høj temperatur på RIDT test ydeevne, er det nødvendigt at vurdere det mere omhyggeligt. På samme måde kræver virkningen af høj temperatur under opbevaring og transport af enheden efter brug til viral RNA-detektion og genotypering yderligere evaluering. Følsomheden af den virale RNA-påvisning af RT-qPCR fra RIDT-strimlen kan påvirkes af kvaliteten af den hjerneprøve, der oprindeligt blev anvendt i testen, men også af tilstanden af opbevaring af RIDT-testene efter brug. For eksempel var RNA-detektionens følsomhed højere, når ridt-test blev opbevaret under kontrollerede laboratorieforhold (94,7 %) sammenlignet med under feltbetingelser (f.eks.¹⁴ Disse betingelser kan også påvirke integriteten (især længden) af RNA, der er fastgjort på strimlen, hvilket muligvis forklarer den moderate følsomhed for genotypering baseret på længere PCR-ampliconer (f.eks. >500 nukleotider)¹⁴. Følsomheden af RT-qPCR udført på teststrippen var lavere end den, der blev opnået ved hjælp af FTA Whatman-kort (80,6 %)¹⁴. I lighed med andre molekylære teknikker kan den virale belastning også påvirke genotypingens succes baseret på RDIT-strimler med potentielle negative resultater for prøver med lav viral belastning¹⁴.

Testen er på nuværende tidspunkt ikke anbefalet af WHO og OIE til rutinemæssig diagnosticering og sygdomsovervågning, og et resultat kan ikke bruges alene til at vejlede PEP-beslutningstagningen. Der er stadig behov for yderligere testvalidering. En præcis hurtig rabiesdiagnose er imidlertid et afgørende element i velfungerende kontinuerlige rabiesovervågningssystemer og er medvirkende til at øge det politiske engagement, hvilket er yderst vigtigt for en vellykket bæredygtig rabieskontrol³³. RIDT-test giver nye muligheder for rabiesdiagnostik i denne sammenhæng og er et nyttigt redskab til at udvide overvågningen af rabies i dyr i marken i lav- eller mellemindkomstområder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed)	Bio-Rad, France	3572112	Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, France	4351104	Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper	-	-	Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, France	3574911	Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit	BioNote Inc., Republic of Korea	RG18-01DD	Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega, USA	N2515	Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, France	11732-020	Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent	Invitrogen, France	15596026	Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.