Felt Postmortem Rabies Rapid Immunochromatographic Diagnostic Test for Ressursbegrensede innstillinger med ytterligere molekylære applikasjoner

Summary

Vi presenterer en komplett protokoll for postmortem diagnose av dyr rabies under feltforhold ved hjelp av en rask immunochromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernen biopsi prøvetaking til endelig tolkning. Vi beskriver også ytterligere applikasjoner ved hjelp av enheten for molekylær analyse og viral genotyping.

Abstract

Funksjonelle rabies overvåkingssystemer er avgjørende for å gi pålitelige data og øke den politiske forpliktelsen som er nødvendig for sykdomskontroll. Hittil må dyr mistenkt som rabies-positive sendes til en postmortem bekreftelse ved hjelp av klassiske eller molekylære laboratoriemetoder. De fleste endemiske områdene er imidlertid i lav- og mellominntektsland hvor dyreab rabiesdiagnose er begrenset til sentrale veterinærlaboratorier. Dårlig tilgjengelighet av overvåkingsinfrastruktur fører til alvorlig sykdom underrapportering fra avsidesliggende områder. Flere diagnostiske protokoller som krever lav teknisk ekspertise har nylig blitt utviklet, noe som gir mulighet til å etablere rabiesdiagnose i desentraliserte laboratorier. Vi presenterer her en komplett protokoll for feltpostmortem diagnose av dyr rabies ved hjelp av en rask immunochromatografisk diagnostisk test (RIDT), fra hjernen biopsi prøvetaking til den endelige tolkningen. Vi fullfører protokollen ved å beskrive en videre bruk av enheten for molekylær analyse og viral genotyping. RIDT oppdager lett rabiesvirus og andre lyssavirus i hjerneprøver. Prinsippet om slike tester er enkelt: hjernemateriale påføres på en teststrimmel hvor gullkonjugerte antistoffer binder seg spesielt til rabiesantigener. Antigen-antistoff komplekser binde videre til faste antistoffer på testlinjen, noe som resulterer i en tydelig synlig lilla linje. Viruset er inaktivert i teststrimmelen, men viral RNA kan senere ekstraheres. Dette gjør at teststrimmelen, i stedet for den smittsomme hjerneprøven, trygt og enkelt sendes til et utstyrt laboratorium for bekreftelse og molekylær skriving. Basert på en endring av produsentens protokoll, fant vi økt testfølsomhet, og nådde 98% sammenlignet med gullstandardreferansemetoden, den direkte immunofluorescensantistofftesten. Fordelene med testen er mange: rask, enkel å bruke, lave kostnader og ingen krav til laboratorieinfrastruktur, for eksempel mikroskopi eller kaldkjedesamsvar. RIDTs representerer et nyttig alternativ for områder der referansediagnostiske metoder ikke er tilgjengelige.

Introduction

Canine rabies er den viktigste årsaken til menneskelige rabies, globalt ansvarlig for ca 59.000 menneskelige dødsfall per år, nesten alle forekommer i lav- og mellominntektsland (LMICs) i Asia og Afrika¹. Hovedetikologisk middel er en nevrotropisk hund-assosiert klassisk rabies virus (RABV, familie Rhabdoviridae, slekten Lyssavirus, arter Rabies lyssavirus). Men andre rabies-relaterte lyssavirus, for det meste sirkulerer i flaggermusarter, forårsaker også sykdom^2,3. I berørte regioner blir sykdomsovervåking og kontroll ofte hindret av lavt nivå politisk engasjement sannsynligvis på grunn av mangel på pålitelige data^4,5,6. En grunn til sykdomsunderrapportering er fraværet av laboratoriediagnose, delvis på grunn av begrenset tilgang til utstyrte laboratorier og opplært personale, samt vanskelighetene med forsendelse av prøvene. Laboratoriediagnose er nødvendig for å bekrefte rabies tilfeller og i tillegg tillater genetisk karakterisering av de involverte stammer, noe som gir innsikt i virusoverføring på regionalt nivå^4,5,7.

De nåværende gullstandardene for postmortem rabies diagnose, godkjent av både Verdens helseorganisasjon (WHO) og Verdens organisasjon for dyrehelse (OIE), er den direkte fluorescerende antistofftesten (DFAT), den direkte raske immunohistokjemitesten (DRIT) og molekylære metoder (f.eks omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-PCR))^4,8. Riktig bruk i LMI-er er imidlertid fortsatt begrenset på grunn av utilstrekkelige laboratoriefasiliteter med inkonsekvent strømforsyning, ukjølt prøvetransport og mangel på et kvalitetsstyringssystem. Fordi dyreab rabies diagnose vanligvis bare utføres ved sentrale veterinærlaboratorier i LMICs, eksisterende overvåkingsdata gjenspeiler hovedsakelig rabies situasjonen i urbane områder.

Nylig utviklede lavteknologi diagnostiske alternativer tilbyr muligheter til å etablere rabies diagnose i avsidesliggende områder og desentraliserte rabies laboratorier^4,8,9. Den raske immunokrommatografiske diagnostiske testen (RIDT) er en lateral strømningstest basert på immunochromatografi ved hjelp av gullkonjugerte detektorantistoffer og er et svært lovende rabies diagnostisk verktøy^{10,,11,,12,13}. Prinsippet er enkelt: Etter fortynning blandes hjernematerialet i den medfølgende bufferen, og noen få dråper påføres på teststrimmelen der gullkonjugert monoklonale antistoffer binder seg spesielt til rabiesantigener, hovedsakelig nukleoproteinene (Figur 1). Antigen-antistoff komplekser deretter gjennomgå lateral flow migrasjon, bindende på testlinjen (T-linje) til faste antistoffer mot rabies antigener, noe som resulterer i en tydelig synlig lilla linje. De resterende gullkonjugerte antistoffene som ikke er bundet til rabiesantigener, fortsetter å migrere og festes til membranen gjennom flere målrettingsantistoffer, noe som resulterer i en tydelig synlig lilla kontrolllinje (C-linje).

Ett-trinns, lav pris metoden er rask, ekstremt enkel og krever ikke dyrt utstyr eller spesielle lagringsforhold. Med modifikasjon av produsentprotokollen for å eliminere fortynningstrinnet, er nesten alt utstyr og reagenser som kreves for å utføre testen inkludert i settet¹⁴. Resultatet leses etter 5-10 minutter uten mikroskop. Dette er en stor fordel over DFAT-testen, som krever et fluorescensmikroskop og immunfluorescenskonjugat, sammen med nedkjølt transport og prøvelagring. Selv DRIT-testen, som kan utføres ved hjelp av et lett mikroskop, krever en kontinuerlig kald kjede for å lagre anti-rabies antistoffer, som heller ikke er kommersielt tilgjengelige. I forhold til DRIT krever RIDT ingen giftige kjemikalier, en spesiell fordel i land der avfallshåndtering er dårlig regulert. Den raske testen er mindre tidkrevende med mye enklere tolkning sammenlignet med gullstandardtestene DFAT og DRIT. Dette gjør det mulig for testing på stedet av personell med begrenset teknisk ekspertise.

Basert på disse testeendelene blir rask diagnose av mistenkte dyr i avsidesliggende områder mulig, noe som letter implementeringen av posteksponeringsprofylakse (PEP) for eksponerte mennesker så snart som mulig. I tillegg er avstandstransport av rabiesprøver ikke nødvendig, noe som resulterer i bedre prøvekvalitet på tidspunktet for testing. Resultatene som oppnås med RIDT-testene, bør imidlertid for tiden bekreftes ved hjelp av en referansediagnostisk test som DFAT eller DRIT.

RIDT-teknikker for påvisning av RABV og andre lyssavirus er evaluert. En av de første studiene ble utført av koreanske forskere i 2007¹⁰. Sammenlignet med DFAT-metoden, i 51 dyreprøver og 4 RABV-isolater, viste RIDT en følsomhet og spesifisitet på henholdsvis 91,7 % og 100 %. Disse resultatene ble senere bekreftet med 110 dyrehjerneprøver fra Korea, med følsomhet og spesifisitet, sammenlignet med DFAT, på henholdsvis 95% og 98,9%,¹⁵. Mer nylig vurderte andre studier ytelsen til denne RIDT ved hjelp av virusisoler og/ eller infiserte hjerneprøver fra ulike dyr med forskjellig geografisk opprinnelse. Et panel på 21 prøver, inkludert afrikanske RABV og andre afrikanske lyssavirus (Duvenhage virus (DUVV), Lagos bat virus (LBV) og Mokola virus (MOKV)), ble vellykket oppdaget, med følsomhet på 100% sammenlignet med DFAT¹⁶. Lignende høy følsomhet (96,5 %) og spesifisitet (100 %) verdiene ble hentet fra et panel på 115 hjerneprøver fra Etiopia¹⁷. En annen studie evaluerte europeiske RABV isolater, to andre europeiske lyssavirus (europeisk bat lyssavirus type 1 (EBLV-1) og type 2 (EBLV-2)), og den australske bat lyssavirus (ABLV)¹⁸. Basert på analyse av 172 dyrehjerneprøver hadde RIDT-settet 88,3 % følsomhet og 100 % spesifisitet sammenlignet med DFAT, og de tre rabiesrelaterte lyssavirusene ble oppdaget. I denne studien kom noen av de falske negative resultatene fra hjerneprøver lagret i glyserolbuffer, noe som tyder på at feil glyserolfjerning påvirket kapillærstrøm eller antistoffbinding. En nylig analyse av 43 kliniske prøver fra australske bekreftet tidligere testresultater, med fullstendig konkordans til DFAT¹⁹. To studier ble utført i India ved hjelp av RIDT på et begrenset antall kliniske prøver (11 og 34 prøver). Sammenlignet med DFAT var følsomheten mellom 85,7% og 91,7% og spesifisitet var 100%^20,,21. En annen evaluering av dette settet ved hjelp av 80 dyre hjerneprøver fra Afrika, Europa og Midtøsten fikk fullstendig konkordans med DFAT for spesifisitet (100%) men en høyere følsomhet (96,9 %) sammenlignet med tidligere studier²². I en nylig inter-laboratorie sammenligning av denne RIDT utført i 22 forskjellige laboratorier ved hjelp av et panel på 10 prøver, total konkordans var 99,5%²³.

Bare en nylig multisentrisk studie viste utilfredsstillende samlet RIDT ytelse²⁴. Prøver fra tre forskjellige datasett ble testet og gitt variabel følsomhet og spesifisitetsverdier sammenlignet med DFAT. For eksempel, følsomhet og spesifisitet oppnådd med det første panelet (n = 51) og det andre panelet (n = 31) av prøver fra eksperimentelle infiserte dyr, alle testet i laboratorium A, ga en følsomhet på henholdsvis 16% og 43%, mens spesifisiteten var 100% for begge. Omvendt ga resultatene av det tredje panelet (n = 30) av feltkliniske prøver analysert av laboratorie B en fullstendig konkordans med resultatene av DFAT, som ble ytterligere nesten fullstendig bekreftet av laboratorie A (85% følsomhet og 100% spesifisitet). Batch-til-batch-variasjon ble foreslått som en mulig forklaring på den varierende relativt lave følsomheten med RIDT²⁴.

Samtidig utførte en annen studie en lignende valideringsprosess av ovenfor beskrevet RIDT, med en endring av produsentens anbefalte protokoll¹⁴. Fortynningstrinnet (1:10) i PBS ble utelatt under utarbeidelsen av hjernematerialet. Basert på denne enklere modifiserte protokollen, forfatterne fikk følsomhet og spesifisitet på 95,3% og 93,3%, sammenlignet med DFAT ved testing, under laboratorieforhold, et datasett på 73 dyr hjerneprøver, naturlig eller eksperimentelt infisert med ulike RABV stammer. Studien presenterte den første evalueringen av denne RIDT i en feltinnstilling (Tsjad, Afrika). I 48 kliniske hjerneprøver var følsomhet og spesifisitet henholdsvis 94,4 % og 100 %. Avvikene mellom DFAT og RIDT skyldtes falske positive resultater med DFAT, bestemt etter bekreftelse med RT-PCR. Når disse resultatene ble slettet, var det fullstendig konkordans, og det viste at RIDT var mer pålitelig at DFAT under disse feltforholdene¹⁴. Ingen batch-til-batch-variasjon ble observert ved hjelp av den endrede protokollen. Når den modifiserte protokollen ble brukt på et lite antall DFAT / RIDT divergerende prøver (n = 8) i studiet av Eggerbauer et al.²⁴, alle ble funnet concordant (100% følsomhet).

En annen stor fordel med RIDT er sekundær bruk for å oppdage viral RNA festet på stripen ved hjelp av molekylære teknikker (for eksempel RT-PCR) og påfølgende genotyping^14,24. Etter et ekstraksjonstrinn demonstrerte Léchenne et al.¹⁴ viral RNA festet på Anigen-enhetsmembranen ved hjelp av RT-PCR med 86,3 % følsomhet i et panel på 51 prøver (inkludert 18 prøver testet og sendt fra Tsjad ved omgivelsestemperatur). Påfølgende genotyping var mulig i 93% av de 14 prøvene som ble testet. Det ble brukt pcr-ampliconer på minst 500 nukleotider i lengde. I tillegg til RABV isolater, testen oppdaget fire andre lyssavirus arter, DUVV, EBLV-1, EBLV-2 og Bokeloh bat lyssavirus (BBLV), under en fullt concordant internasjonal inter laboratorietest¹⁴. Følsomheten for viral RNA-deteksjon var enda høyere (100 %) i studien av Eggerbauer et al., basert på laboratorieprøver undersøkelse²⁴. Den sistnevnte studien viste også at bufferen som brukes i RIDT-settet inaktivert virus. Dermed kan enhetene sendes enkelt, ved omgivelsestemperatur uten spesifikke forholdsregler for biosikkerhet for å referere til laboratorier, for molekylær bekreftelse og genotyping.

Basert på tidligere evalueringer tilbyr RIDT-verktøy mange fordeler for bruk i feltinnstillinger, spesielt når referansediagnostiske teknikker ikke er tilgjengelige. Denne testen har imidlertid også noen begrensninger, spesielt lav følsomhet for antigendeteksjon^14,24. Testen gjelder for prøver som inneholder store mengder virale antigener, for eksempel hjerneprøver. Det er imidlertid ikke hensiktsmessig for andre prøver som spytt eller andre kroppsvæsker. En annen ulempe er kostnaden for enheten (rundt 5-10 euro i Europa), som er billigere i forhold til kostnadene ved å utføre DFAT, RT-PCR eller DRIT, men som fortsatt er høy for LMICs. Imidlertid kan fremtidig utvikling og validering av lignende RIDTs fra andre selskaper føre til en prisnedgang. En studie rapporterte batch-til-batch variasjoner. Selv om det ikke rapporteres av andre, bør strenge kvalitetskontroller likevel utføres når du tester et nytt parti, som for enhver reagens som brukes i et kvalitetsstyringsmiljø. Bruken av den endrede protokollen ble ikke endret ved bruk av forskjellige partier¹⁴. Alle unntatt én studie viste at følsomheten til RDIT var høy sammenlignet med DFAT (rundt 90%-95%). Fordi rabies alltid er dødelig, anbefales det fortsatt sterkt å bekrefte eventuelle negative resultater med RDIT ved hjelp av en referansediagnostisk test som DFAT, DRIT eller RT-PCR¹⁴.

I dette manuskriptet presenterer vi en komplett protokoll for feltpostmortemdiagnose av dyreab rabies basert på et eksempel på en kommersialisert RIDT, fra hjerneprøvesamling til anvendelse av en modifisert protokoll sammenlignet med produsentens anbefalinger (som tidligere ble validert¹⁴) og påfølgende molekylær analyse. Denne protokollen ble brukt og validert mange ganger under feltforhold i Vest- og Sentral-Afrika, hvor RIDT ble brukt rutinemessig for rabies diagnose sammen med DFAT-testen. Vi demonstrerer også et annet program for enheten, i laboratorieinnstillinger, for ekstraksjon og deteksjon ved hjelp av RT-PCR av viral RNA festet på enheten.

Protocol

1. Prøvesamling via foramen magnum (occipital rute)²⁵

MERK: Denne teknikken kan implementeres under laboratorieforhold eller i feltinnstillinger. Prøvene skal behandles så snart som mulig etter at det mistenkte dyret døde eller oppbevares ved kjølig temperatur (nedkjølt eller frosset, om mulig) for å unngå nedbrytning som kan påvirke resultatene. I likhet med andre referanseteknikker basert på lyssavirusantigendeteksjon som DFAT og DRIT, bør dekomponerte prøver ikke testes fordi det kan påvirke resultatet (risiko for falskt negativt resultat).

FORSIKTIG: Alle prøver bør betraktes som potensielt smittsomme. Sikkerhetsforskrifter og prosedyrer bør følges nøye, selv i feltinnstillinger⁴. Spesielt bruk passende personlig verneutstyr, inkludert maske, briller, hansker og en labfrakk. Bruk egnet desinfeksjonsmiddel for material- og prøvedekontamineringer (f.eks. natriumhypokloritt med anbefalt produsentfortynning, 70 % alkohol - etanol eller isopropanol, 1 % såpeoppløsning). Alle personellhåndteringsprøver bør vaksineres mot rabies.

1. Fjern dyrehodet med en kniv før den første livmorhalsen (atlas vertebra) for å få tilgang til foramen magnum.
   MERK: For å minimere infeksiøs aerosol, unngå å bruke en manuell sag eller lignende verktøy.
2. Samle hjernestammen (medulla oblongata) prøve ved hjelp av en engangs plast pipette (Figur 2A), en drikking halm ( Figur2B), en klemme (Figur 2C) eller en dropper (leveres med RIDT) (Figur 2D).
   MERK: Spesiell oppmerksomhet må gis når du samler inn prøven, fordi det er et ytterste viktig skritt for påliteligheten av resultatene. I tillegg til den tilknyttede videoen som viser på en enkel måte hvordan man samler den delen av hjernestammen av interesse, anbefales et treningstrinn sterkt for å sikre å samle den riktige anatomiske delen.
3. Eventuelt og i tillegg til hjernestammen (medulla oblongata), samle andre deler av hjernestammen eller hjernen (lillehjernen, hippocampus, thalamus og cortex) ved samme occipital rute ved å skyve og rotere plastpipetten eller halm mot øyehulen (Figur 3).
4. Hvis du bruker et halm eller pipette, må du forsiktig klemme den for å deponere hjerneprøven (0,5-2 g) i et rør for etterfølgende analyse og/eller biobanking.
   MERK: Prøvelagring i glyserol anbefales ikke, da det ser ut til å påvirke kapillærstrømmen eller antistoffbindingstrinnet til RIDT¹⁸.

2. Gjennomføring av den modifiserte RIDT-protokollen¹⁴

MERK: Denne endringen utelater et fortynningstrinn (1:10) i PBS, som angitt i produsentprotokollen (alle versjoner), og kan implementeres under laboratorie- eller feltinnstillinger.

1. Bruk vattpinnen/dropperen til å samle tilsvarende en halv peanøtt eller ert (0,1-0,5 g) hjernemateriale og plasser den i bufferprøverøret.
   MERK: For den modifiserte protokollen er alle reagenser/forbruksvarer inkludert i settet (ingen PBS eller ekstra rør er nødvendig) (Figur 4). Dokumenter partinummeret til settet og kontroller gyldigheten av utløpsdatoen.
2. Knus hjernematerialet forsiktig direkte i røret med vattpinnen eller dropperen i ca. 30 s til en homogen suspensjon oppnås.
   MERK: Bufferreaksjonen inaktiverer virusets infeksialitet under betingelsene i produsentens protokoll²⁴.
3. Ved hjelp av dropperen setter du fire dråper (ca. 100 μL) av suspensjonen i prøveinntaket på testenheten.
4. Vent til fullstendig prøveoverføring (1-5 min) før du leser testenheten. Flyttingen bør starte raskt etter innskudd av prøven (1-5 min).
5. Ved forsinkelse (på grunn av høy viskositetsuspensjon) eller for å akselerere starten av migrasjonen, skrap forsiktig bunnen av innskuddsstedet til enheten med dropperen (1-5 ganger) og til slutt legge til 1-2 flere dråper. Migrering bør starte umiddelbart etterpå.
6. Les testresultatet i registreringsvinduet etter 5-10 min, og ikke mer enn 20 min, etter slutten av overføringen.
7. Tolke resultatet basert på tilstedeværelse eller fravær av kontrolllinjen (C-linje) og testlinje (T-linje) (lilla linjer) i gjenkjenningsvinduet, i henhold til figur 5. Vurder utvalget positivt når to linjer er synlige (Figur 5A), negativ hvis bare C-linjen finnes ( figur5B) og ugyldig hvis bare T-linjen finnes, eller hvis ingen linjer er synlige ( figur5C).
   MERK: Ugyldige resultater bør gjentas minst én gang. Andre teknikker bør utføres hvis resultatene forblir ugyldige. Negative resultater oppnådd med RIDT må senere bekreftes ved hjelp av en gullstandard referansemetode, som DFAT, DRIT og molekylære metoder (polymerasekjedereaksjon eller PCR). Selv om følsomheten til denne testen er høy (se representative resultater), er det ikke 100%.
8. Oppbevar brukte enheter ved romtemperatur, eller kjøle/fryse når det er mulig, for etterfølgende molekylær analyse (se avsnitt 4). Frys gjenværende prøvefjæring ved -20 °C/-80 °C i bufferrøret for å gjenta testen om nødvendig eller for påfølgende molekylær analyse.

3. RNA-ekstraksjon og deteksjon av RT-qPCR fra RIDT-enheten

MERK: Dette trinnet kan bare implementeres under laboratorieforhold med tilpasset miljø og egnet utstyr for molekylær diagnose. Det kan gjøres kort tid etter RIDT-testen eller retrospektivt på arkiverte RIDT-enheter, lagret ved romtemperatur (15-30 °C), nedkjølt eller frosset.

1. RNA-ekstraksjon
   MERK: For å overvåke ekstraksjonstrinnet anbefales det å bruke en intern kontroll som kan være en endogene mRNA (for eksempel ß-actin) eller en eksogen kontroll (for eksempel eGFP syntetisk RNA) direkte pigget inn i prøven under de første trinnene i ekstraksjon^26,27.
   1. Åpne enheten forsiktig og fjern filterpapiret.
   2. Klipp avsetningsområdet på prøven og plasser den i et rør som inneholder 1 ml Tri-Reagens LS. Inkuber ved RT i 1 time med forsiktig regelmessig manuell agitasjon.
   3. Utfør ekstraksjonen i samsvar med produsentens anbefalinger, som tidligere beskrevet²⁷. På dette trinnet kan den eksogene interne kontrollen legges til.
   4. Under prosessen legger du til 2 μL glykogen for å lette nedbøren av RNA, i henhold til produsentens anbefalinger.
   5. Juster det endelige volumet for RNA-resuspension i nukleasefritt vann, med et volum på 50 μL som vanligvis brukes.
      MERK: På slutten av sentrifugeringstrinnet for vandig og organisk faseseparasjon (etter tilsetning av 200 μL kloroform i Tri-Reagens LS), vil membranen fra enheten være på bunnen av røret og ikke forstyrre innsamlingen av den øvre vandige fasen. Alternativt kan andre enkle og raske protokoller brukes, for eksempel ved hjelp av fenolbaserte reagenser og silikamembraner²⁸.
2. Deteksjon av RT-qPCR²⁶
   MERK: Påvisning av potensielle virale RNA til stede i ekstraherte prøver kan gjøres ved hjelp av ulike molekylære teknikker, for eksempel omvendt transkripsjon PCR, konvensjonell (endepunkt) eller sanntid PCR (qPCR). Flere metoder er tilgjengelige, for eksempel konvensjonelle RT-PCR^27,,29 eller RT-qPCR^26,,30 rettet mot viral nukleoprotein eller polymerase genet. Et eksempel vil bli presentert nedenfor basert på en dobbel kombinert pan-lyssavirus RT-qPCR rettet mot en bevart region blant viral polymerase. Denne RT-qPCR-teknikken knytter to forskjellige RT-qPCR: en basert på TaqMan-sondeteknologien (pan-RABV RT-qPCR) og den andre ved hjelp av SyBR Green-deteksjon (pan-lyssa RT-qPCR). I tillegg er påvisning av en eksogen intern kontroll (eGFP RNA) direkte pigget under utvinningsprosessen gjort av en bestemt TaqMan probebasert RT-qPCR (eGFP RT-qPCR). Forsiktig validering på stedet av molekylære teknikker valgt for påvisning av viral RNA er viktig, spesielt for å kontrollere at primere, og sonder for sanntid RT-PCR, er tilpasset for påvisning av stammer som sirkulerer i regionen av interesse⁴.
   1. Fortynn RNA-prøven til 1:10 i nukleasefritt vann. Test hver RNA-prøve i duplikat, ved hjelp av en 96-brønns reaksjonsplate eller andre formater. Bruk positive og negative kontroller for hver analyse og test minst i duplikat.
   2. Forbered master mix reaksjonsløsningen for de tre forskjellige RT-qPCR-analysene i henhold til tabell 1, og med primere / prober angitt i tabell 2.
   3. Tilsett 5 μL fortynnede RNA-prøver og 15 μL hovedblanding til hver av de tre forskjellige analysene. Pan-RABV RT-qPCR-analysen og eGFP RT-qPCR-analysen kan sykle i samme plate.
   4. Kjør de forskjellige analysene etter de termiske sykkelforholdene som er angitt i tabell 3. Hvis bare én PCR termisk sykluser er tilgjengelig, start med pan-RABV RT-qPCR og hold platen for pan-lyssa RT-qPCR ved 4 °C til slutten av pan-RABV RT-qPCR.
   5. Analyser resultatene som er oppnådd med de tre analysene i henhold til tabell 4.

4. Genotyping etter RNA-ekstraksjon fra RIDT-enheten

1. Omvendt transkripsjon RT^27,29
   1. Forbered en hovedblanding med 6 μL RNA, 2 μL pd(N)6 tilfeldige primere (200 μg/μL) og 2 μL kjernevann for et endelig volum på 10 μL.
   2. Inkuber ved 65 °C i 10 min i en varmeblokk og oppbevar deretter på is.
   3. Forbered en hovedblanding med 6 μL 5x første-strandbuffer, 2 μL av 0,1 M dithiothreitol (DTT), 1 μL (200 U) av Superscript II reverstranskriptase, 2 μL (80 U) av RNasin, 2 μL dNTP mix (10 μM) og komplett med nukleasefritt vann for å få et endelig volum på 20 μL for hvert utvalg.
   4. Tilsett hovedmiksen (20 μL) i prøven (10 μL) (siste volum på 30 μL) og inkuber ved 42 °C i 90 min i en varmeblokk.
   5. Fortsett til neste trinn med PCR-forsterkning eller lagre cDNA ved -20 °C.
2. Konvensjonell PCR^27,29,31
   MERK: Ulike teknikker for konvensjonell PCR er tilgjengelige for genotyping. To presenteres, både hemi-nestet PCR, rettet mot en del av nukleoproteinet eller en del av det virale proteinet i lyssaviruset. Protokollen er den samme for hver av disse analysene, med unntak av primere og sykkelforhold. Positive (positive RNA) og negative (negative cDNA- og/eller nukleasefrie vann)-kontroller bør inkluderes i hver serie og hver runde med PCR.
   1. Forbered deg på hver prøve i en 0,2 ml mikrotube en master mix reaksjonsløsning for det første PCR-trinnet. Denne blandingen inneholder 5 μL av 10x NH4 reaksjonsbuffer, 2,5 μL mgcl₂ oppløsning (50 mM), 1 μL dNTP Mix (10 μM), 1 μL av hver primer (10 μM), 0,2 μL (1 E) biotaq DNA polymerase og 37,3 μL nukleasefritt vann (endelig volum på 48 μL). Primers er angitt i tabell 5.
   2. Tilsett 2 μL cDNA i hvert rør og syklus på en separat konvensjonell PCR termisk sykluser for hver analyse, i henhold til tabell 6.
   3. Forbered en annen master mix reaksjonsløsning identisk med den forrige med å bruke de riktige primers (Tabell 5) for hemi-nestet PCR reaksjon.
   4. Tilsett 2 μL av det første runde PCR-produktet og sykle på en vanlig PCR termisk sykluser ved hjelp av sykkelparametrene som er angitt i tabell 6.
   5. Visualiser de forskjellige PCR-produktene (første og andre runde PCR) etter å ha lastet dem på en 1% agarose gel (100 ml Tris-acetat EDTA buffer 1x - TAE 1x) med ethidiumbromid (endelig konsentrasjon rundt 0,01%) og kjøre gelen under 30 min ved 120 V. Et positivt PCR-resultat observeres i form av et lyst bånd av forventet størrelse (Tabell 5).
3. Sanger sekvensering
   1. Utfør en Sanger-sekvensering av ampliconene som er oppnådd med pan-lyssavirus hemi-nestet PCR og fullfør genotypinganalysen.

Discussion

RIDT er en enkel, rask og rimelig metode for postmortem rabies diagnose og et lovende felt alternativ til laboratorietesting. Anvendelsen av en slik test, spesielt for desentraliserte områder av lav- og mellominntektsland, ville forbedre forståelsen av rabiesvirusprevalens og overføring på en lokal og potensielt nasjonal skala. Når den kombineres med den raske hjerneprøveinnsamlingsmetoden (uten full necropsy), er en stor fordel at testen kan utføres helt i feltinnstillingen, vekk fra laboratorieanlegg. Hjerneprøver samlet inn via foramen magnum kan brukes til testing, og det er derfor ikke nødvendig å åpne dyreskallen helt. Testen er enkel å utføre og tolke og er spesielt egnet for feltovervåkingsaktiviteter¹⁴. Andre fordeler med RIDT over DFAT eller DRIT er ikke behov for positive og negative kontroller og kit lagring ved romtemperatur. I tillegg er den modifiserte protokollen, der fortynningstrinnet (1:10) i PBS utelates, ikke krever ekstra reagenser for å utføre testen og forenkle prosedyren ytterligere under feltforhold.

Et sentralt punkt er kvaliteten på hjerneprøvene. Prøver bør samles inn og testes så snart som mulig etter at det mistenkte dyret døde, eller holdes ved kjølig temperatur før testing, for å unngå nedbrytning. Nedbrutte prøver bør ikke testes fordi det kan påvirke resultatet (risiko for falskt negativt resultat). Selv om ingen data ennå er tilgjengelige om tap av følsomhet for RIDT over tid for hjerneprøver, hypoteser vi at det er likt i forhold til DFAT-testen³². Men tiden mellom dyrets død og utførelse av testen kan reduseres, da testen kan gjøres raskt og direkte i feltet. Dermed er det generelt en lavere risiko for nedbrutte prøver.

Et annet kritisk skritt i protokollen er prøvesuspensjonsoverføringen. Overføringen bør starte direkte etter innskudd av prøven (1-5 min). Høy viskositet av suspensjonen kan derfor negativt påvirke migrasjonen. Forsiktig riper bunnen av enheten innskuddsstedet med dropperen og legge til 1-2 flere dråper løser ofte dette problemet, og migrasjonen begynner umiddelbart etter.

De fleste RIDT-testene utført i afrikanske laboratorier (Tsjad, Elfenbenskysten og Mali) ble utført ved omgivelsestemperatur som kan overstige 30 °C, mens temperaturområdet for lagring og bruk anbefalt av produsenten er 15 °C - 30 °C. Selv om vi ikke identifiserte noen innvirkning av høy temperatur på RIDT testytelse, er det nødvendig å evaluere det mer nøye. På samme måte trenger virkningen av høy temperatur under lagring og transport av enheten etter bruk for viral RNA-deteksjon og genotyping ytterligere evaluering. Følsomheten til viral RNA-deteksjon av RT-qPCR fra RIDT-stripen kan påvirkes av kvaliteten på hjerneprøven som først ble brukt i testen, men også av tilstanden til lagring av RIDT-testene etter bruk. Følsomheten til RNA-deteksjonen var for eksempel høyere når brukte RIDT-tester ble lagret under kontrollerte laboratorieforhold (94,7 %) sammenlignet med under feltforhold (f.eks. Tsjad) (81,2 %)¹⁴. Disse forholdene kan også påvirke integriteten (spesielt lengden) av RNA festet på stripen, muligens forklare moderat følsomhet for genotyping basert på lengre PCR amplicons (f.eks> 500 nukleotider)¹⁴. Følsomheten til RT-qPCR utført på teststrimmelen var lavere enn den som ble oppnådd ved hjelp av FTA Whatman-kort (80,6 %)¹⁴. I likhet med andre molekylære teknikker, kan virusbelastningen også påvirke suksessen til genotyping basert på RDIT-strimler, med potensielle negative resultater for prøver med lav viral belastning¹⁴.

Testen er for tiden ikke anbefalt av WHO og OIE for rutinemessig diagnose og sykdomsovervåking, og et resultat kan ikke brukes alene til å veilede PEP beslutningstaking. Ytterligere testvalidering er fortsatt nødvendig. Imidlertid er nøyaktig rask rabies diagnose et avgjørende element i velfungerende kontinuerlige rabies overvåkingssystemer og er medvirkende til å øke politisk engasjement, noe som er eminent viktig for vellykket bærekraftig rabies kontroll³³. RIDT tester tilbyr nye rabies diagnostiske muligheter i denne sammenhengen og er et nyttig verktøy for å utvide dyr rabies overvåking i feltet i lav- eller mellominntekt enzootiske områder.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Rabies Nucleocapsid Conjugate (lyophilizied, adsorbed)	Bio-Rad, France	3572112	Fluorescein-5-isothiocyanate (FITC) conjugated polyclonal antibody against the nucleocapsid of rabies virus. Use for the DFAT reference tecnnique.
Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, France	4351104	Amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
Disposable plastic pipette, drinking straw, clamp, dropper	-	-	Equipment used for the collection of the brain stem (medulla oblongata) via the foramen magnus (occipital route).
Evans Blue Solution 1%	Bio-Rad, France	3574911	Counter-coloration used for the DFAT to facilite the reading under UV microscope.
Primer eGFPF1	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GACCACTACCAGCAGAACAC-3'.
Primer eGFPR2	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the internal control eGFP by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GAACTCCAGCAGGACCATG-3'.
Primer Taq17 revlong	Eurofins Genomics, Germany	-	Reverse primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-ATGAGAAGTGG AAYAAYCATCA-3'.
Primer Taq3 long	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-GATCTGTCTGAA TAATAGAYCCARG-3'.
Probe eGFP FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Forward primer for the amplification of the internal control by RT-qPCR after extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGCACCCAGT CCGCCCTGAGCA-3'.
Probe RABV4 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AACACYTGATCBA GKACAGARAAYACATC-3'.
Probe RABV5 FAM/TAMRA	Eurofins Genomics, Germany	-	Probe for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after RNA extraction from the RIDT device, sequence: 5'-AGRGTGTTTTCYAG RACWCAYGAGTTTTTYCA-3'.
Rapid Rabies Ag Test Kit	BioNote Inc., Republic of Korea	RG18-01DD	Rapid immunochromatographic diagnostic test (RIDT, also named lateral flow device or LFD) for the post-mortem diagnosis of rabies.
Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor	Promega, USA	N2515	Enzyme used with the kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
SuperScript III Platinum One-Step qRT-PCR Kit	Invitrogen, France	11732-020	Kit for the amplification of the viral RNA by RT-qPCR after extraction from the RIDT device.
TRIzol Reagent	Invitrogen, France	15596026	Phenol/chloroforme based total RNA extraction using the cellulose membrane of the RIDT.