Luminescence Lifetime Imaging of O2 con un sistema de cámara basado en dominio de frecuencia

Summary

Describimos el uso de una novedosa cámara de duración de luminiscencia de dominio de frecuencia para mapear distribuciones 2D O₂ con láminas de sensor óptico. El sistema de cámaras y los procedimientos de análisis de imágenes se describen junto con la preparación, calibración y aplicación de láminas de sensores para visualizar el microambiente O₂ en la rizoesfera de plantas acuáticas.

Abstract

Describimos un método para la imagen de oxígeno disuelto (O₂), en 2D a alta resolución espacial (< 50-100 m) y temporal (< 10 s). El método emplea láminas de sensor luminiscentes sensibles O₂ (optodos planos) en combinación con un sistema de cámara especializado para la vida útil de la luminiscencia de imágenes en el dominio de frecuencia. Los optodos planos se preparan disolviendo el tinte indicador sensible O₂en un polímero y extendiendo la mezcla sobre un soporte sólido en un espesor definido a través del recubrimiento de cuchillo. Después de la evaporación del disolvente, el optode plano se pone en estrecho contacto con la muestra de interés - aquí demostrado con las raíces de la planta acuática Littorella uniflora. El cambio dependiente de la concentración O₂ en la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador dentro del optode plano se toma una imagen a través de la parte posterior de la lámina portadora transparente y la pared del acuario utilizando una cámara especial. Esta cámara mide la vida útil de la luminiscencia a través de un cambio en el ángulo de fase entre una señal de excitación modulada y la señal de emisión. Este método es superior a los métodos de imagen de intensidad de luminiscencia, ya que la señal es independiente de la concentración o intensidad del tinte de la fuente de excitación, y se basa únicamente en el tiempo de decaimiento de la luminiscencia, que es un parámetro referenciado intrínsecamente. Por consiguiente, no se necesita un tinte de referencia adicional u otros medios de referencia. Demostramos el uso del sistema para la toma de imágenes macroscópicas O₂ de rizoesferas vegetales, pero el sistema de cámara también se puede acoplar fácilmente a un microscopio.

Introduction

La distribución y dinámica de gases e iones disueltos en sedimentos y suelos proporcionan información clave sobre procesos biogeoquímicos como la respiración microbiana^1,2, o la pérdida radial de oxígeno de las raíces de las plantas^3,4,5, y el microambiente químico de microbios^6,7, rizosferas vegetales^5,8,9 y madrigueras animales^{10, 11,12}. La actividad biológica y química en estos entornos limitados por difusión puede crear pendientes pronunciadas de sustratos químicos o productos de procesos biogeoquímicos. En particular, la disponibilidad de O₂ tiene un gran impacto en los procesos biogeoquímicos y, por lo tanto, en la biología y ecología de un sistema^13. Por lo tanto, el análisis de las concentraciones de O₂ a alta resolución espacial y temporal es de suma importancia en las ciencias acuáticas y terrestres. En primer lugar, se desarrollaron microsensores electroquímicos y ópticos^14,15 para medir este importante analito. Más tarde, se introdujeron imágenes en 2 dimensiones (2D) de O₂ con optodes planos^{12,16,17,18,19}, lo que permitió la visualización y cuantificación de la distribución heterogénea De₂ en suelos y sedimentos.

Los optodos Planar O₂ consisten en un indicador de_o2sensible dye^20,que se disuelve en un polímero adecuado^21. El tinte indicador se excita en longitudes de onda ópticas específicas y emite luz de desplazamiento rojo tras la relajación en forma de luminiscencia. En presencia de O_2,el tinte indicador excitado puede transferir su energía a la molécula O₂ tras la colisión, que se conoce como enfriamiento de luminiscencia basado en colisión^22. Por lo tanto, la intensidad de la luminiscencia, así como la vida útil de la luminiscencia se reducen con el aumento de la concentración de O₂ ^{2 23}. En un caso ideal, el cambio de intensidad y de vida útil sigue la ecuación Stern-Volmer (ecuación 1) utilizando la intensidad de luminiscencia o la vida útil en ausencia (I₀;₀) o la presencia (I, ) de O₂ a una concentración dada [Q]. La constante Stern-Volmer (K_sv) es una medida para la sensibilidad del optode hacia O₂; K_SV depende de variables ambientales como la temperatura y la presión.

(1)

La grabación de estos cambios en la luminiscencia sobre una lámina plana del sensor con un sistema de cámara se puede utilizar para visualizar los cambios correspondientes en la distribución de O_2. Inicialmente, se utilizaron imágenes O₂ simples basadas en la intensidad de luminiscencia^18. Sin embargo, esta metodología es muy sensible a las interferencias externas, que comprometen la fiabilidad de los resultados debido a la iluminación heterogénea, las fluctuaciones en la fuente de excitación o la cámara, así como la distribución desigual del tinte indicador dentro del optodo plano.

Algunas de estas limitaciones se pueden aliviar mediante el uso de optodos planos para la imagen ratiométrica^17,24, donde el tinte indicador sensible O₂se inmoviliza en la capa de polímero del optodo plano con un tinte de referencia insensible que emite en un rango espectral diferente al indicador O_2. Basándose en imágenes de emisión adquiridas en dos ventanas espectrales, la señal de emisión sensible O₂se divide por la señal de referencia, generando una imagen de relación menos propensa a las interferencias mencionadas anteriormente^5,17. El método requiere el uso de un segundo tinte, que idealmente puede ser excitado por la misma fuente de excitación, pero emite a una longitud de onda diferente (sin superposición espectral significativa), en otra ventana espectral de la cámara (por ejemplo, en otro canal de color de una cámara RGB).

Alternativamente, la imagen O₂ puede basarse en la cuantificación del cambio dependiente de O₂en la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador, que no se ve afectado por la iluminación desigual o las heterogeneidades en la concentración del indicador²⁵. Los primeros sistemas de imágenes O₂ basados en la duración de la luminiscencia se basaron en mediciones de dominio del tiempo con un sistema de cámara de dispositivo acoplado cargado (CCD)^26,donde se utiliza una fuente de excitación pulsada y las imágenes de luminiscencia se toman sobre intervalos de tiempo definidos dentro de la excitación o emisión del indicador^8,23,27. A partir de estas imágenes, la vida útil de la luminiscencia se puede determinar y correlacionar con la concentración correspondiente de O₂ en una calibración. Posteriormente, las imágenes de vida útil de la luminiscencia de una muestra determinada presionada contra el optode plano se pueden convertir en imágenes de la distribución 2D correspondiente de la concentración de O_2. Este sistema se ha utilizado en muchas aplicaciones tanto en el laboratorio como in situ^16,28,pero la cámara CCD esencial capaz de compuerta ya no está disponible comercialmente.

Recientemente, se lanzó un sistema de cámara de vida de iluminación luminiscencia diferente, que adquiere imágenes en el dominio de frecuencia⁸. El sistema se basa en una fuente de luz modulada continuamente para la excitación. Esto puede ser una onda sinusoidal o cuadrada en lugar de una excitación pulsada, que se utiliza para la adquisición de imágenes en el dominio del tiempo. Esta modulación da como resultado una emisión de luminiscencia modulada del tinte indicador O_2, que se desplaza por fases por un ángulo, , que depende de la vida útil de la luminiscencia del tinte indicador (véase la ecuación 2).

(2)

El cambio entre la excitación y la amplitud de emisión (es decir, el denominado índice o profundidad de modulación (amplitud dividida por la parte de luminiscencia constante)) también depende de la vida útil de la luminiscencia. Por lo tanto, mediante el establecimiento de una frecuencia de modulación conocida, el sensor de imagen CMOS especial dentro de la cámara es capaz de medir la vida útil de la luminiscencia en el rango ns a s como se describe en detalle en otros lugares ^8,29,30. Se puede encontrar una guía general sobre el principio de funcionamiento (utilizando el siguiente enlace https://www.youtube.com/watch?v=xPAB_eVWOr8).

En el siguiente protocolo, demostramos el uso del novedoso sistema de cámaras para la toma de imágenes de la distribución de la concentración de O₂ alrededor de las raíces de la planta de agua dulce acuática Littorella uniflora en 2D^9,31. Nos gustaría hacer hincapié en que este método no se limita de ninguna manera a esta aplicación. Los optodos sensibles al oxígeno o las partículas de^{sensores 27} en combinación con diversos métodos de imagen se han utilizado en la investigación médica^32,en la bioimpresión^33,para pinturas sensibles a la presión^34,35,o para estudiar sistemas fotosintéticos^2,36,37, sólo para nombrar algunos otros campos de aplicación.

Protocol

1. Fabricación de optode planar O₂

1. Disolver 1,5 mg del indicador luminiscente O₂ colorante platino(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP) y 100 mg de poliestireno (PS) en 1 g de cloroformo para obtener el llamado 'cóctel'.
   NOTA: El cóctel se puede guardar en un vial de vidrio cerrado y hermético durante unas horas en la nevera y la oscuridad hasta su uso posterior.
2. Fijar una lámina de tereftalato de polietileno (PET) limpia y libre de polvo (tamaño dependiendo de la aplicación) en una placa de vidrio limpia con la ayuda de un agua o etanol (70%) película(Figura 1A).
3. Coloque el dispositivo de recubrimiento de cuchillo limpio (120 m) en la lámina y aplique una línea del cóctel del sensor delante del dispositivo utilizando una pipeta de vidrio(Figura 1B). A continuación, arrastre el dispositivo de recubrimiento de cuchillo lentay uniformemente sobre la lámina PET para extender el cóctel uniformemente.
   NOTA: Todos los materiales y herramientas deben limpiarse a fondo y la fabricación debe realizarse en un entorno libre de polvo, como una campana de humos, un banco de flujo o debajo de un dispositivo de aspiración de puntos. Para evitar heterogeneidades en la lámina final del sensor, los pasos que siguen a la aplicación del cóctel sensor sobre la lámina deben realizarse rápidamente, ya que el cloroformo se evapora rápidamente.
4. Secar el optode plano terminado O₂-sensible en el aire ambiente durante 1 h y luego durante la noche en un armario de calefacción a 50-60 oC, lo que resulta en un espesor de capa final después de la evaporación del disolvente de 12 m. Almacene los optodos producidos en la oscuridad (por ejemplo, en un sobre de papel) hasta su uso posterior(Figura 1C).
   NOTA: Los optodos Planar O₂ se pueden almacenar secos y en la oscuridad durante varios meses a años antes de su uso. Un espesor de capa final que va de 1-20 m ha demostrado ofrecer buenos resultados, con suficiente señal de luminiscencia y tiempos de respuesta adecuados.

2. Cámara rhizo-sandwich

1. Limpie dos placas de vidrio (24,5 x 14 cm^2,espesor: 4 mm) con 96% de etanol.
2. Utilice adhesivo instantáneo a base de acrílico curable a la luz (ver Tabla de Materiales)para pegar diapositivas de microscopio (76 x 26 mm², espesor: 1 mm) a lo largo de los bordes de la primera placa de vidrio (es decir, el lado de la cámara trasera), dejando un borde largo abierto. Utilice un cortador de vidrio para acortar las diapositivas del microscopio según sea necesario.
   ADVERTENCIA: Cortar vidrio puede causar bordes afilados y debe ser manejado con cuidado.
   NOTA: Las diapositivas del microscopio funcionan como espaciadores entre la parte delantera y trasera, y dependiendo del grosor de las raíces y el tamaño de la planta, se pueden pegar varias capas de diapositivas de microscopio una encima de la otra.
3. Corte el optode plano en la forma y el tamaño requeridos para caber en el espacio entre las diapositivas del microscopio pegado. Colóquelo en el interior de la placa de vidrio frontal con el lado recubierto hacia arriba, para permitir el contacto con la muestra de interés cuando se presiona contra ella.
4. Pegue un borde de la lámina de optode a la placa de vidrio y agregue unas gotas de agua del grifo entre la placa de vidrio y la lámina de optode(Figura 2A). Baje lentamente la lámina de estas gotas de agua, lo que le permite enderezarse en la superficie de vidrio.
5. Retire cuidadosamente las burbujas de aire atrapadas entre el optode plano y la placa de vidrio utilizando un tejido blando, evitando el rayado del recubrimiento del sensor. Limpie la placa de vidrio en seco y pegue los bordes restantes de la lámina de optode a la placa de vidrio(Figura 2B).
   NOTA: Se debe elegir una cinta con una adherencia adecuada bajo el agua.
6. Tamizar el sedimento usando un tamaño de malla de 0,5 mm. Coloque una cuchara de sedimento húmedo en la primera placa de vidrio(Figura 2C).
   NOTA: El tamaño de la malla no debe ser mayor que la mitad del grosor del espaciador.
7. Distribuya el sedimento uniformemente y ajústelo al mismo grosor que los espaciadores deslizantes del microscopio utilizando una placa de vidrio plana. Limpie cuidadosamente la superficie superior de las guías del microscopio para asegurarse de que la segunda placa de vidrio selle la cámara correctamente.
8. Aplique grasa de silicio a la superficie deslizante del microscopio. Cubra el sedimento con una película de agua fina, evitando cuidadosamente la formación de burbujas de aire.
9. Lavar cuidadosamente un solo brote de Littorella uniflora y colocarlo en el sedimento, con las hojas de la planta sobresaliendo desde el lado abierto superior(Figura 2D).
10. Colocar la segunda placa de vidrio, con el optode unido a ella, sobre el sedimento y aplicar una presión suave para poner el optode en estrecho contacto con las raíces de la planta y el sedimento circundante.
    NOTA: Las burbujas de aire atrapadas en el sedimento se pueden eliminar inclinando las placas de vidrio mientras las une.
11. Fije las placas de vidrio usando abrazaderas(Figura 2E). Seque los bordes exteriores con papel tisú. Mantener las hojas hidratadas durante todo el conjunto del rizo-sandwich (por ejemplo, por la adición frecuente de unas gotas de agua).
12. Apriete la cámara de rizo-sandwich con cinta eléctrica de vinilo. Sellar los bordes con arcilla de modelado y además grabarlos con cinta eléctrica de vinilo(Figura 2F).
    NOTA: Si hay muchas burbujas de aire en el sedimento, o granos de sedimento entre los portaobjetos del microscopio espaciador y la segunda placa de vidrio, la cámara debe volver a montarse ya que el agua de los poros puede escaparse (repetir los pasos 2.4 - 2.8).
13. Use un plástico opaco para cubrir el rizo-sandwich, pero deje una hendidura en el papel de aluminio para que las hojas de la planta sobresalgan. Cortar una ventana en la lámina de plástico, por lo que se puede abrir para los experimentos por desdoblamiento. Cierre la ventana durante los tiempos de aclimatación utilizando bandas de goma(Figura 2G)para proteger el optode del blanqueamiento fotográfico mientras la planta está incubada.
    NOTA: Como el crecimiento de algas podría interferir potencialmente con las concentraciones de O₂ medidas, recomendamos tratar de minimizarlo, mediante el uso de agua filtrada, equipos experimentales prelimpiados y la eliminación de algas en el momento de la formación.

3. Incubación de cámara de rizo-sandwich

1. Coloque la cámara rizo-sandwich en un tanque de agua (32 x 7 x 28 cm³) en una posición ligeramente inclinada para fomentar el crecimiento de la raíz contra el optode plano.
2. Llene el tanque de agua con suficiente agua para sumergir completamente las hojas de la planta.
3. Establecer un ciclo oscuro de 14 h de luz y 10 h para la aclimatación de la planta utilizando una lámpara de control de tiempo. Coloque una bomba de aire o de agua en el tanque para asegurar la aireación y la mezcla del agua(Figura 2H).

4. Imágenes

1. Configuración de imágenes
   1. Retire la lámina de plástico que cubre el optodo plano en la cámara de rizo-sandwich. Coloque la cámara con la pared de cristal con el optode en posición vertical contra la pared del acuario. Usa un espaciador para presionar la cámara de rizo-sandwich contra la pared del acuario.
      NOTA: El espesor total de la pared del acuario más la pared de la cámara rizo-sandwich no debe ser demasiado grueso, sin embargo, los espesores de vidrio para las paredes de acuario para la iluminación se recomiendan con > 1 cm, con el fin de reducir la cruz espacial mediante el aumento de la atenuación de la luz dispersa. Es importante, utilizar el mismo material para ambas paredes de vidrio (mismo índice refractario), con el fin de minimizar la dispersión de la luz en la interfaz del material; ya que esto llevaría a una imagen borrosa, así¹².
   2. Coloque la cámara de vida de intensidad luminiscencia basada en dominio de frecuencia equipada con un objetivo (ver Tabla de Materiales)delante del acuario y el área de interés (raíces de la planta acuática Littorella uniflora, que están en contacto directo con el optode plano) (Figura 3).
      NOTA: La cámara se puede colocar en un soporte de laboratorio para permitir un ajuste sencillo de la altura de la cámara. La posición del soporte de laboratorio debe marcarse y mantenerse fija. Además, la cámara se puede pegar en el soporte de laboratorio para evitar el movimiento accidental de la cámara durante el experimento.
   3. Atornille un filtro de emisión adecuado para la toma de imágenes PtTFPP como tinte indicador (ver Tabla de materiales)en el objetivo de la cámara, para eliminar las inferencias de la fuente de excitación.
      NOTA: Los filtros atornillados son ideales, pero los filtros cuadrados también se pueden utilizar con un adaptador adecuado, o pegándolos cuidadosamente al objetivo.
   4. Conecte una fuente de excitación LED (consulte Tabla de materiales)a la modulación y salida de compuerta oscura de la cámara.
      NOTA: El primero proporciona la señal de modulación para la fuente de luz, mientras que el segundo apaga la luz durante la lectura de la imagen del sensor de imagen. Conecte la fuente de excitación LED y la cámara a un ordenador. La luz de fondo debe minimizarse durante la lectura de la imagen, ya sea oscureciendo toda la habitación o poniendo un paño denso y negro sobre toda la configuración. En este último caso, es importante garantizar una ventilación suficiente para evitar el calentamiento de la cámara.
   5. Fije la guía de luz en la fuente de excitación LED y colóquela para iluminar uniformemente la lámina de optode plana que cubre el área de interés.
      NOTA: En la fuente de excitación LED utilizada es posible cambiar entre 3 LEDs diferentes (460 nm, 528 nm, 625 nm), cuyo intensidad se puede ajustar a través del software de control.
2. Ajustes y funcionamiento de la cámara
   NOTA: Para los experimentos descritos, utilizamos una cámara de por vida basada en dominio de frecuencia en combinación con un módulo dedicado para imágenes de por vida en un paquete de software disponible comercialmente (consulte Tabla de materiales).
   1. Seleccione la cámara en el software elegido antes de usarlo.
      NOTA: Los controladores de software y cámara deben instalarse antes de la toma de imágenes siguiendo las directrices del fabricante.
   2. Abra el software de control LED (de nuevo instalado antes de iniciar el experimento) y elija el LED adecuado (aquí: 528 nm) marcando el modo de espera. Ajuste la intensidad del LED según sea necesario (aquí al 30%). Asegúrese de que el LED sea activado por el TTL externo; esto se hace marcando analógico y sincronizando para el LED.
      NOTA: La intensidad del LED debe ajustarse individualmente, ya que una potencia láser demasiado alta puede conducir a un blanqueo fotográfico acelerado del indicador o del tinte de referencia.
   3. Enfoque la cámara y ajuste la apertura del objetivo manualmente (en el presente estudio utilice f s 2.8).
      NOTA: Es importante enfocar la cámara en el optode plano y no en el cristal del acuario; esto se puede asegurar tomando una imagen con una regla para la escala, y centrándose en la sombra de la regla en el optode, en lugar de en la regla real.
   4. Establezca los siguientes parámetros en el panel de control de la cámara del software: fuente de modulación interna; onda sinusoidal para la forma de onda de salida; muestreo de fase adicional (Sí); 8 muestras de fase, orden de fase opuesta, lectura de toque A + B; Frecuencia de modulación de 5 kHz.
      NOTA: Estos parámetros afectan a la calidad de la imagen y se pueden cambiar si es necesario. El fabricante de la cámara proporciona pautas sobre los parámetros individuales (El fabricante de la cámara está lanzando directrices y actualizaciones cada vez que el software se actualiza).
   5. Tome una imagen de referencia antes de los experimentos.
      NOTA: Esto se puede hacer mediante imágenes de un estándar de calibración (un tinte luminiscente con una vida útil conocida (ns o s)), o utilizando la luz reflejada del LED. En este último caso, el filtro de paso largo de emisión debe eliminarse del objetivo y la vida útil conocida se puede establecer en 1 ns.
   6. Ajuste el tiempo de exposición en la sección de calibración del software de imágenes dedicado hasta que la lectura de ROI Statistics (en la parte inferior de este panel) para la imagen de intensidad de luminiscencia normalizada esté en el rango de 0.68 - 0.72.
      NOTA: Ahora la duración de la referencia (por ejemplo, 1 ns) se da como entrada para el software.
   7. Pulse Capturar referencia para iniciar la adquisición de una serie de medición de referencia.
      NOTA: Cuando haya terminado, los datos de referencia se almacenan y se pueden realizar mediciones de un solo lapso de tiempo en muestras.
3. Calibración del optode O₂
   1. Coloque un pedazo de un optode sensible o₂plano en un acuario de vidrio (pequeño). Fije el optode plano en la pared de vidrio de la cámara de calibración como se describió anteriormente (ver sección 2.3). Coloque el acuario de calibración delante de la cámara. Garantice una iluminación uniforme por el LED, así como que el optode llene todo el campo de visión.
      NOTA: El optode plano debe ser de la misma pieza de papel de aluminio o hecho del mismo cóctel sensor que la lámina utilizada en el experimento real.
   2. Llene el acuario con el mismo medio líquido que se utiliza en los experimentos.
      NOTA: El uso de diferentes medios para calibraciones y experimentos puede influir en la medición (por ejemplo, cambiando la respuesta del sensor y/o la solubilidad de O_2). Por lo tanto, la calibración debe hacerse en el mismo medio, y a la misma temperatura que el experimento real. Las fluctuaciones de temperatura afectarán a la señal de luminiscencia y deben evitarse. Sin embargo, si la temperatura no se puede mantener estable, la compensación de la temperatura debe hacerse calibrando el optodo sensible O₂(múltiples puntos) a diferentes temperaturas (relevantes) y el posterior recálculo de los valores.
   3. Ajuste la concentración de O₂ dentro del acuario de calibración descargando el agua con una mezcla de gas de aire/N₂ de concentración conocida de O_2, utilizando un dispositivo de mezcla de gas. Asegúrese de que el agua esté bien equilibrada con la mezcla de gas usada aireando durante un tiempo suficiente (depende del caudal y el tamaño del acuario).
      NOTA: Recomendamos monitorear el nivel De₂ en el acuario de calibración con un sensor O₂ externo calibrado con compensación de temperatura (por ejemplo, utilizando un sensor de fibra óptica o electroquímico O_2).
   4. Tome una serie de imágenes en diferentes concentraciones de O₂ en la cámara de calibración.
      NOTA: Se deben medir al menos cinco concentraciones diferentes de O₂ para permitir un ajuste adecuado de la curva a los datos de calibración adquiridos. Es importante medir a 0 hPa (condiciones anóxicos) y luego distribuir los otros valores en el rango dinámico de su tinte indicador específico. Aquí usamos PtTFPP como el tinte indicador sensible O₂inmovilizado en una matriz de poliestireno. Las imágenes fueron tomadas a 0, 48, 102, 156 y 207 hPa; 207 hPa corresponde al 100% de saturación de aire en la salinidad y presión dada.
4. Imagen de la muestra
   1. Coloque la muestra delante de la cámara y garantice una iluminación uniforme.
   2. Apague la luz que suministra irradiación a la planta (y a todas las demás fuentes de luz) justo antes de adquirir la imagen de vida útil de la luminiscencia de la planta. Ajuste el tiempo de adquisición en función de la imagen de intensidad, asegurándose de que la señal no esté sobresaturada ni demasiado débil para una buena relación señal/ruido (S/N) en la determinación de la vida útil.
   3. Exponer la planta a diferentes condiciones de luz (por ejemplo, luz/oscuridad) y adquirir un conjunto de imágenes.
   4. Encienda la luz de la habitación para adquirir una imagen estructural.
      NOTA: Cuando la luz de fondo está encendida, la cámara no medirá una imagen realista de por vida. Sin embargo, la imagen de intensidad ahora muestra todo el campo de visión como se ve a través del optode semitransparente.
   5. Tome una imagen con una regla o similar en el campo de visión para habilitar el escalado posterior de las imágenes adquiridas.

5. Análisis de datos

1. Exporte las imágenes de duración de fase e intensidad directamente desde el software de imágenes dedicado, utilizando la macro proporcionada por el fabricante de la cámara.
2. Realice más análisis de imágenes utilizando un software de análisis de imágenes de libre acceso (consulte Tabla de materiales).
3. Abra las imágenes de duración de fase de la calibración en el software de análisis de imágenes y determine la media de toda la imagen utilizando la función de medición. Trazar las vidas útiles medidas con respecto a las concentraciones o₂ conocidas para determinar la función de calibración(Figura 4A).
4. Calcular _{a partir} de todos los datos (₀ es la duración de la fase medida en ausencia de O₂). Trazar estos valores frente a las concentraciones O₂ conocidas(Figura 4B).
5. Determine los parámetros K_sv y f de la gráfica de calibración, utilizando el modelo simplificado de dos sitios para el enfriamiento dinámico de colisiones (ecuación 3)^38,39 donde [Q] es la concentración de O_2. Defina la función de ajuste en el software de análisis de datos, que luego determina K_sv y f.

(3)

6. Abra las imágenes de muestra adquiridas en el software de análisis de imágenes para convertir las vidas útiles de las imágenes en concentraciones de O_2, utilizando los parámetros determinados K_sv, f y ₀.
   NOTA: Como enfoque alternativo, también se pueden utilizar directamente los valores de duración de la fase de calibración adquirida(figura 4A). En este caso, se utiliza un ajuste exponencial mediante la función de ajuste de curva para la calibración.
7. Abra la imagen con la regla siguiente en el software de análisis de imágenes y mida una distancia conocida utilizando la herramienta de medición. Establezca esta medida como escala global en Establecer escala.

Discussion

En este protocolo, se cubre todo el flujo de trabajo desde la preparación del optode hasta el análisis de imágenes O_2. Siguiendo este protocolo, se pueden obtener imágenes químicas utilizando la nueva cámara de duración de la luminiscencia basada en el dominio de frecuencia. Dependiendo de la aplicación, los optodos planos se pueden fabricar en varios tamaños y espesores de capa de la capa del sensor que van desde pesados optodos planos de 50-100 m de espesor de varias décimas de centímetro cuadrado hasta resbalones de cubierta del microscopio con capas de sensor de <1 m de espesor^6,40. El potencial de este método se demostró con una aplicación particular, pero no sólo se limita a la toma de_imágenes O 2 en rizoesferas vegetales^12,28.

Este método tiene varios beneficios en comparación con los métodos de imagen química basados en intensidad de luminiscencia pura. Las imágenes de por vida luminosa no se ven afectadas, o al menos mucho menos, por la iluminación desigual, el grosor desigual del piso de los pliegues y el blanqueo fotográfico^25. Además, este método evita el uso de un tinte de referencia adicional común en la imagen ratiométrica^17,37. En comparación con otros sistemas de cámaras basados en la vida útil, como las cámaras de dominio del tiempo cerradas de uso común^8,26, el nuevo sistema de cámara y el protocolo presentado aquí pueden ofrecer resultados comparables. En una publicación reciente, se compararon las características analíticas de esos dos sistemas y se encontró que el sistema de cámaras de vida útil de luminiscencia basado en dominios de frecuencia es al menos comparable al predecesor de sintibronse basado en el dominio del tiempo⁸.

Hemos presentado el optode O₂ más simple que consiste únicamente en un indicador en una matriz de polímeros. Además de múltiples otros posibles^indicadores O₂ que podrían ser utilizados aditivos pueden incluirse, es decir, agentes de dispersión como TiO₂ o polvo de diamante² para aumentar la señal del sensor mientras se reduce la transparencia del optode. También se pueden utilizar destidados adicionales para mejorar la intensidad de la señal a través de la transferencia de energía⁴¹.

Para la fabricación de optode plano, se recomienda utilizar un hueco en el dispositivo de recubrimiento de cuchillas de 75 - 120 m para producir un espesor final de la capa del sensor de alrededor de 7,5 a 12 m después de la evaporación del disolvente (alrededor del 10% de la brecha utilizada), cuando se utiliza la composición de cóctel del sensor descrita. Este es un buen compromiso entre la intensidad de la señal, que se puede modificar mediante una mayor carga de tinte, o mediante la elección de tintes de indicador y referencia de mayor brillo, y el tiempo de respuesta. Un aumento en el espesor de la capa se traduce en un aumento en el tiempo de respuesta, ya que el intervalo de tiempo necesario para que el analito alcance un equilibrio termodinámico en la capa de sensibilidad con el medio circundante aumenta¹².

Los optodes, como se describe aquí, reaccionan a los cambios en la concentración de O₂ en pocos segundos¹⁷ mientras siguen teniendo una señal de luminiscencia suficientemente fuerte. Los recubrimientos de sensores ultradelgados con tiempos de respuesta de menos de un segundo se pueden realizar con recubrimiento de espín^6. Si el soporte o el dispositivo de recubrimiento de cuchillo sin limpiar bien, podría dar lugar a capas de sensores no homogéneas. Además, cuando el cóctel no es completamente homogéneo o se aplica demasiado rápido después de extenderse delante del dispositivo de recubrimiento tal resultado no deseado se puede observar. Por lo tanto, es posible que necesite algo de práctica para preparar optodes óptimos.

El método se puede utilizar para tomar imágenes de muestras que se pueden poner en contacto con el optode, como ciertos animales marinos⁴², biopelículas⁶ y suelos³¹ sólo para nombrar unos pocos. Presentamos una configuración independiente utilizando un objetivo, sin embargo, la cámara se puede acoplar fácilmente a un microscopio para imágenes químicas de mayor resolución^43.

Mientras que la imagen de vida útil de luminiscencia basada en dominio de tiempo permitió la supresión de la fluorescencia en segundo plano^26,esto es un problema cuando se utiliza el nuevo sistema de cámara basado en dominio de frecuencia⁸. Debido a la adquisición continua de imágenes, esta cámara grabará cualquier fluorescencia de fondo de la muestra que pueda ser excitada por el LED seleccionado y emita en la ventana espectral seleccionada según lo definido por el filtro de emisión en el objetivo de la cámara. Esto resultará en una vida aparentemente más baja y, por lo tanto, en lecturas falsas. En caso de trabajar con muestras con una fluorescencia intrínseca significativa superpuesta con la excitación y emisión del sensor O_2, es esencial aplicar un aislamiento óptico adicional en la parte superior del optode, recubriendo una capa adicional que contenga negro de carbono^2,17. Por lo tanto, sólo la luminiscencia emitida por el optode plano llegará a la cámara. Con el fin de comprobar la luminiscencia de fondo, se puede tomar una imagen sin el optode, que luego mostraría exclusivamente luminiscencia intrínseca de la muestra. También es posible añadir agentes de dispersión como TiO₂ o polvo de diamante^2,44, al cóctel sensor, para aumentar la intensidad de la luminiscencia del tinte indicador. Sin embargo, esto también puede conducir a un blanqueo fotográfico más rápido y TiO₂ es un fotocatalizador conocido, que puede afectar a la fotoestabilidad de un tinte^41. Otro aspecto a tener en cuenta es la luz de fondo. Cuando la duración de la luminiscencia de la imagen, la luz de fondo debe evitarse de la manera más eficiente posible. Por lo tanto, este método de imagen requiere que la configuración se coloque en un entorno oscuro y cualquier fuente de luz externa debe desactivarse temporalmente durante la adquisición de la imagen.

En resumen, la imagen de por vida de luminiscencia es un método de imagen química robusto que se puede adaptar a muchas aplicaciones diferentes. Este protocolo (ver sección 1 - 5) cubre todos los pasos esenciales para generar una imagen O₂ y utiliza el sistema de imágenes de vida útil de luminiscencia de dominio de frecuencia más flexible actualmente, que puede reemplazar la cámara de dominio del tiempo cerrada descontinuada para imágenes 2D O₂ con optodos planos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Air pump with air stone and water pump	Local aquarium store
Chloroform	Sigma Aldrich	67-66-3
DC4 silicone compound	Dow Corning GmbH	2793695
Gas mixer	Vögtlin Instruments GmbH	red-y compact meter GCM	This is just one possible instrument. Several companies offer gas mixing devices
Glass plates and aquaria	Local aquarium or hardware store
ImageJ Software	ImageJ		Freely available imaging software (imagej.nih.gov/ij/index.html)
Knife-coating device	BYK-GARDNER GMBH byk.com	2021	This is a four sided film applicator enabling easy variation of the film thickness. Other versions are also available. We recommend a thickness of the applied film between 75-120 µm, which yields a final sensor layer thickness of ~10% of the applied thickness before solvent evaporation.
LED lamp, Reflector PAR38	Megaman	MM17572
LED LEDHUB	Omicon Laserage, Germany		Can be configured with a variety of LEDs. For the presented example, the green LED (528 nm) is essential
LOCTITE AA 3494	Henkel AG & Co. KGaA	NA	Acrylic-based instant adhesive
NIS Elements AR Software	Nikon Inc		Software package used for image acquisition
pco.flim	PCO AG, Germany		Frequency domain based luminescence lifetime camera
platinum(II)-5,10,15,20-tetrakis-(2,3,4,5,6-pentafluorphenyl)-porphyrin (PtTFPP)	Frontier Scientific	PtT975	O2 indicator
polyethylene terephthalate (PET) foil	Goodfellow	320-992-72	Such foils might also be found from other providers and serve as solid support
Polystyrene (PS)	Sigma Aldrich	9003-53-6	Polymer matrix
Schott RG610 filter	www.uviroptics.com		Here 52mm screw on Filters can obtained. Other sources offer square glass filters from Schott glass that can be fixed in front of the objective
Vinyl electrical tape	Scotch, Super 33+	NA
Zeiss Makro Planar 2/100 with Hama C for Nikon adaptor	delivered with the camera		Here any other objective might also be used in combination with an adaptor if the objective does not have a C-mount