Fase sólida 11C-Metilación, purificación y formulación para la producción de trazadores PET

Resumen

Reportamos una técnica eficiente de radioetiquetado carbono-11 para producir trazadores clínicamente relevantes para la tomografía por emisión de positrones (PET) utilizando cartuchos de extracción de fase sólida. ¹¹ El agente metilante C se pasa a través de un cartucho precargado con elución precursora y sucesiva con etanol acuoso proporciona trazadores PET química y radioquímicamente puros en altos rendimientos radioquímicos.

Resumen

La producción rutinaria de radiosondas utilizada en la tomografía por emisión de positrones (PET) se basa principalmente en la química húmeda donde el sintetizador radiactivo reacciona con un precursor no radiactivo en solución. Este enfoque requiere la purificación del trazador mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) seguida de reformulación en un disolvente biocompatible para administración humana. Recientemente desarrollamos un novedoso enfoque de ¹¹C-metilación para la síntesis altamente eficiente de radiofármacos PET etiquetados con carbono-11, aprovechando los cartuchos de fase sólida como unidades desechables "3-en-1" para la síntesis, purificación y reformulación de los trazadores. Este enfoque evita el uso de HPLC preparativo y reduce las pérdidas del trazador en las líneas de transferencia y debido a la descomposición radiactiva. Además, la técnica basada en cartuchos mejora la fiabilidad de la síntesis, simplifica el proceso de automatización y facilita el cumplimiento de los requisitos de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP). Aquí, demostramos esta técnica en el ejemplo de la producción de un trazador PET compuesto de Pittsburgh B ([¹¹C]PiB), un agente de imagen in vivo estándar de oro para placas amiloideas en los cerebros humanos.

Introducción

La tomografía por emisión de positrones (PET) es una modalidad de imagen molecular que se basa en la detección de la descomposición radiactiva de un isótopo unido a una molécula biológicamente activa para permitir la visualización in vivo de procesos bioquímicos, señales y transformaciones . El carbono-11 (t_1/2 x 20,3 min) es uno de los radioisótopos más utilizados en PET debido a su abundancia en moléculas orgánicas y vida media corta que permite múltiples administraciones de trazador en el mismo día al mismo sujeto humano o animal y reduce la carga de radiación en los pacientes. Muchos trazadores etiquetados con este isótopo se utilizan en estudios clínicos y en investigaciones básicas de salud para imágenes IN vivo PET de objetivos clásicos y emergentes biológicamente relevantes - [¹¹C]raclopride para receptores D₂/D_3, [¹¹C] PiB para placas amiloideas, [¹¹C]PBR28 para proteína transclodor - por nombrar sólo unos pocos.

Los trazadores PET etiquetados con carbono-11 se producen predominantemente a través de ¹¹grupos C-metilación de precursores no radiactivos que contienen -OH (alcohol, fenol y ácido carboxílico), -NH (amina y amida) o -SH (tiol). En resumen, el isótopo se genera en el objetivo de gas de un ciclotrón a través de una reacción nuclear de ¹⁴N(p,o)¹¹C en forma química de [¹¹C]CO₂. Este último se convierte entonces en [¹¹C]yoduro de metilo ([¹¹C]CH₃I) a través de la química húmeda (reducción a [¹¹C]CH₃OH con LiAlH₄ seguido de temple con HI)¹ o seco química (reducción catalítica a [¹¹C]CH₄ seguida de yodiminación radical con molecular I₂)². [¹¹C] CH₃A continuación, puedo convertirse en el triflato más reactivo ¹¹C-metil ([¹¹C]CH₃OTf) pasándolo sobre una columna triflada de plata³. La metilación ¹¹C se realiza entonces burbujeando el gas radiactivo en una solución de precursor no radioactivo en disolvente orgánico o a través del método de "bucle" de disolvente cautivo más elegante^4,5. El trazador ^{C 11}se purifica por medio de HPLC, se reformula en un disolvente biocompatible y se pasa a través de un filtro estéril antes de ser administrado a sujetos humanos. Todas estas manipulaciones deben ser rápidas y fiables dada la corta vida media de carbono-11. Sin embargo, el uso de un sistema HPLC aumenta significativamente las pérdidas del trazador y el tiempo de producción, a menudo requiere el uso de disolventes tóxicos, complica la automatización y ocasionalmente conduce a sintetizaciones fallidas. Además, la limpieza necesaria de los reactores y la columna HPLC prolonga los retrasos entre las síntesis de los lotes de trazadores posteriores y aumenta la exposición del personal a la radiación.

La radioquímica del flúor-18 (t_1/2 a 109,7 min), el otro isótopo PET ampliamente utilizado, se ha avanzado recientemente mediante el desarrollo de kits basados en casetes que obvian la necesidad de purificación de HPLC. Mediante el empleo de cartuchos de extracción de fase sólida (SPE), estos kits totalmente desechables permiten la producción rutinaria confiable de ¹⁸trazadores F, incluyendo [¹⁸F]FDG, [¹⁸F]FMISO, [¹⁸F]FMC y otros, con síntesis más corta reducción de la participación del personal y mantenimiento mínimo del equipo. Una de las razones por las que carbon-11 sigue siendo un isótopo menos popular en las imágenes PET es la falta de kits similares para la producción rutinaria de ¹¹trazadores C. Su desarrollo mejoraría significativamente la fiabilidad sintética, aumentaría los rendimientos radioquímicos y simplificaría la automatización y el mantenimiento preventivo de los módulos de producción.

Los kits de producción disponibles actualmente aprovechan los cartuchos SPE baratos y desechables en lugar de las columnas HPLC para la separación de la radiosonda de isótopos radiactivos, precursores y otros subproductos radiactivos y no radiactivos no reaccionados. Idealmente, la reacción de radioetiquetado también procede en el mismo cartucho; por ejemplo, la^[18F]fluoromethylation de dimetilaminoetanol con gaseoso [¹⁸F]CH₂BrF en la producción de marcador de IMAGEN de cáncer de próstata PET trazación [¹⁸F]fluorometilcolina se produce en un cartucho de resina de intercambio catiónico ⁶. Aunque procedimientos similares para el etiquetado radioeléctrico de varios ¹¹c-trazadores en cartuchos se han reportado^7,8 y se convirtió en especialmente potente para la radiosíntesis de [¹¹C]colina⁹ y [¹¹C]metionina¹⁰, estos ejemplos permanecen limitados a trazadores ONcológicos PET donde a menudo no se requiere la separación del precursor. Recientemente informamos del desarrollo de "[¹¹C]kits" para la producción de [¹¹C]CH₃I¹¹ y posterior ¹¹C-metilación, así como síntesis sólida apoyada en fase¹² en nuestros esfuerzos por simplificar la producción rutinaria de ¹¹trazadores C. Aquí, queremos demostrar nuestros progresos utilizando el ejemplo de la radiosíntesis apoyada en fase sólida de [¹¹C]PiB, una radiosonda para la imagen a A que revolucionó el campo de la enfermedad de Alzheimer (AD) cuando se desarrolló por primera vez en 2003 ( Figura 1) ^13,14. En este método, volátil [¹¹C]CH₃OTf (bp 100 oC) se pasa sobre el precursor 6-OH-BTA-0 depositado en la resina de un cartucho desechable. El trazador PET [¹¹C]PiB se separa de las impurezas precursoras y radiactivas por elución del cartucho con etanol acuoso biocompatible. Además, automatizamos este método de radiosíntesis [¹¹C]PiB utilizando un módulo de síntesis de radioquímica operado a distancia y kits de casete desechables. Específicamente, implementamos esta radiosíntesis en un módulo de radioquímica de 20 válvulas, equipado con accionamiento de jeringa (dispensador) que se adapta a la jeringa de plástico desechable estándar de 20 ml, controlador de flujo de gas, bomba de vacío y medidor. Debido a la simplicidad de este método, estamos seguros de que se puede modificar a la mayoría de los sintetizadores automatizados disponibles comercialmente, ya sea a base de casete o a aquellos equipados con válvulas estacionarias. Esta técnica de soporte de fase sólida facilita la producción [¹¹C]PiB compatible con las regulaciones de Buenas Prácticas de Manufactura (GMP) y mejora la fiabilidad de la síntesis. La técnica descrita aquí también reduce la cantidad de precursor necesario para la radiosíntesis, utiliza sólo disolventes biocompatibles "verdes" y disminuye el tiempo entre lotes de producción consecutivos.

Protocolo

1. Preparación de tampones y eluyentes

1. Disolver 2,72 g de acetato de sodio trihidrato en 100 ml de agua para preparar 0,2 M de solución de acetato de sodio (solución A).
2. Disolver 11,4 ml de ácido acético glacial en 1 L de agua para preparar 0,2 M de solución de ácido acético (solución B).
3. Combinar 50 ml de solución A con 450 ml de solución B para preparar el búfer de acetato a pH 3,7 (buffer 1) según el centro de referencia del búfer¹⁵. Verifique el pH del tampón con tiras de pH o un medidor de pH.
4. Combinar 12,5 ml de etanol absoluto con 87,5 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 12,5% (lavado 1) en una botella de 100 ml.
5. Combine 15 ml de etanol absoluto con 85 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 15% (lavado 2) en una botella de 100 ml.
6. Combine 5 ml de etanol absoluto con 5 ml de tampón 1 para hacer una solución EtOH acuosa al 50% (eluyente final) y extraiga 2,5 ml de esta solución en una jeringa de 10 ml.

2. Aplicación del precursor del cartucho

1. Pasar 10 ml de agua seguido de 5 ml de acetona a través del cartucho tC18 para preacondicionarlo.
2. Seque el cartucho con una corriente de nitrógeno a 50 ml/min durante 1 min.
3. Disolver 2 mg del precursor 6-OH-BTA-0 en 1 mL de acetona anhidra.
4. Sosteniendo una jeringa de vidrio de precisión Luer-tip de 250 l hacia abajo, retire 100 s de la solución precursora y 50 l de cojín de aire en la parte superior del líquido. Retire la aguja y aplique la solución precursora en el cartucho tC18 del extremo femenino empujando lentamente el émbolo hasta el fondo. ¡No empuje más la solución!

3. Configuración del colector para la síntesis automatizada

1. Asegure el colector desechable estándar de 5 puertos en el módulo de síntesis y ensamblelo de acuerdo con la Figura 2 y los pasos 3.2 - 3.5 a continuación.
   NOTA: Recomendamos el uso de colectores resistentes a la acetona (consulte Tabla de materiales).
2. El puerto 1 tiene dos posiciones. Conecte la entrada horizontal al dispensador automatizado equipado con una jeringa de 20 ml. Conecte la entrada vertical al frasco con el lavado 1.
3. Conecte la salida del módulo que produce [¹¹C]CH₃OTf al puerto 2 del colector.
4. Instale el cartucho tC18 cargado con el precursor 6-OH-BTA-0 entre los puertos 3 y 4.
5. El puerto 5 tiene dos posiciones. Conecte la salida horizontal a la botella de residuos que debe contener al menos 200 ml. Conecte la salida vertical al vial estéril para la recogida del trazador a través del filtro estéril.

4. Radiosíntesis de [¹¹C]PiB

ADVERTENCIA: Todas las manipulaciones relacionadas con isótopos radiactivos deben ser realizadas en una célula caliente blindada por plomo por personal con la formación adecuada para trabajar con materiales radiactivos.
NOTA: Este protocolo no cubre los detalles de la producción de [¹¹C]CO₂ en el ciclotrón y su conversión en [¹¹C]CH₃OTf utilizando el módulo de radioquímica. Estos procedimientos dependerán del equipo individual del laboratorio de radioquímica y están fuera del alcance de este protocolo. Nuestro centro PET está equipado con un ciclotrón IBA, que produce carbono-11 en forma química de [¹¹C]CO₂a través de la reacción nuclear ^{de 14}N(p,o)¹¹C con una mezcla de gas N_2/O2 (99.5:0.5) en el gas objetivo, y un módulo disponible comercialmente para la producción de [¹¹C]CH₃I a través del "método seco" (reducción catalítica a [¹¹C]CH₄ seguida de iodiminación radical). [¹¹C] CH₃OTf se produce pasando [¹¹C]CH₃I sobre una columna de triflos de plata calentada a 175 oC a 20 ml/min.

1. Entregue [¹¹C]CH₃OTf en el colector a través del puerto 2 y pase a través del cartucho tC18 cargado a un flujo de salida de 20 ml/min regulado por el módulo [¹¹C]CH₃OTf, a través de los puertos 3 y 4 y en la botella de residuos como se muestra en Figura 2A.
2. Una vez que toda la radiactividad se ha transferido y atrapado en el cartucho tC18 según lo monitoreado por el detector de radiactividad detrás del soporte del cartucho, detenga el flujo de gas cerrando el puerto 2. Deje que el cartucho se quede durante 2 minutos para completar la reacción.
3. Extraer 19 ml de solución de lavado 1 (ver paso 1.4) del frasco de 100 ml en la jeringa dispensadora a través del puerto 1 a 100 ml/min, como se muestra en la Figura 2B.
4. Dispensar 18,5 ml de solución de lavado 1 del dispensador a través del cartucho tC18 a través de los puertos 3 y 4 y en la botella de residuos a 50 ml/min como se muestra en la Figura 2C. Asegurar la ausencia de burbujas de aire en el colector, ya que podrían disminuir la eficiencia de separación.
5. Repita los pasos 4.3 y 4.4 cuatro veces, retirando y dispensando 18,5 ml de lavado 1 solución cada vez. El volumen total de la solución de lavado 1 pasado a través de tC18 es de 92,5 ml; sin embargo, puede variar dentro del rango de 90 - 100 mL dependiendo del módulo de síntesis particular utilizado.
6. Cambie la línea de entrada en el puerto 1 de lavado 1 a lavado 2 solución (ver paso 1.5).
7. Repita los pasos 4.3 y 4.4 tres veces, retirando y dispensando 18,5 ml de solución de lavado 2 cada vez. El volumen total de la solución wash 2 pasada a través de tC18 es de 55,5 ml. Sin embargo, puede variar dentro del rango de 50 - 60 mL dependiendo del módulo de síntesis particular utilizado.
8. Alternar la válvula 5 hacia el vial final como se muestra en la Figura 2D. Desconecte la línea del dispensador y conéctela a la jeringa de 10 ml que contiene 2,5 ml de la solución eluyente final (50% EtOH acuoso, ver paso 1.6) y 7,5 ml de aire.
9. Sosteniendo la jeringa hacia abajo, empuje manualmente la solución eluyente final (2,5 ml) seguida de aire (7,5 ml) a través del cartucho tC18 a través de los puertos 3 y 4 y en el vial estéril para la recogida del trazador a través del filtro estéril como se muestra en la figura 2D.
10. Desconecte la jeringa vacía, conecte la jeringa de 10 ml que contiene 10 ml del tampón de fosfato estéril (receta no incluida, ya que puede variar) y empuje todo el volumen a través del cartucho tC18 en el vial estéril como se ha descrito anteriormente(Figura 2D ). Desconecte la jeringa y enjuague la línea con 10 ml de aire utilizando la misma jeringa.
11. Retirar 0,7 ml de la formulación final del trazador y recoger muestras para procedimientos de control de calidad (0,1 ml), prueba de endotoxina bacteriana (0,1 ml) y esterilidad (0,5 ml).

5. Procedimientos de control de calidad

ADVERTENCIA: Cada lote de la radiosonda debe someterse a los procedimientos de control de calidad (QC) adecuados antes de su liberación en el sitio de imágenes PET para su administración en sujetos humanos o animales. Los autores de este manuscrito no son responsables del cumplimiento de la radiosonda producida en otros centros con las regulaciones de las autoridades sanitarias locales.

1. Realizar procedimientos de control de calidad previos a la liberación, que deben incluir pruebas de identidad radioquímica (RCI), pureza radioquímica (RCP), pureza química y actividad molar del trazador, así como contenido de disolvente residual y pH de la formulación.
2. Determinar el RCI, RCP, pureza química y actividad molar por medio de un sistema hPLC analítico equipado con UV (monitoreo a 350 nm) y detectores de radiactividad, y una columna de fase invertida. Determinar los tiempos de retención de 6-OH-BTA-0 y 6-OH-BTA-1 y calibrar el instrumento para cuantificar el contenido de cada compuesto.
3. Determinar el contenido residual de disolventemediante según el sistema de cromatografía analítica de gases equipado con una columna capilar. Determinar los tiempos de retención de acetona y etanol y calibrar el instrumento para cuantificar el contenido de cada disolvente.
4. Realice la prueba de endotoxinas bacterianas utilizando un lector de cartuchos equipado con cartuchos adecuados.
5. Realizar el análisis de esterilidad de la muestra al menos 14 días después de la síntesis para asegurar la ausencia de crecimiento bacteriano o enviar la muestra de esterilidad a un laboratorio acreditado por la autoridad sanitaria local.

Resultados

Para resumir una radiosíntesis típica de [¹¹C]PiB, gaseoso [¹¹C]CH₃OTf se pasa primero a través de un cartucho tC18 precargado con una solución de precursor (Figura 1). La separación de la mezcla de reacción se logra entonces mediante la elución sucesiva con soluciones de etanol acuoso de la siguiente manera. En primer lugar, el 12,5% EtOH eluye la mayoría de los_Soluciónde OTf^y6-OH-BTA-0 no reacc...

Discusión

A pesar de la reciente aparición y la aprobación por la FDA de varios ¹⁸marcadores PET con etiqueta F, como florbetapir, florbetaben y flutemetamol, [¹¹C]PiB sigue siendo un marcador estándar de oro para imágenes amiloideas debido a la rápida aparición cerebral y baja inespecífico Vinculante. Actualmente este trazador se sintetiza a través de la química húmeda¹⁶ o utilizando un enfoque de "bucle seco"^4,17...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525