Fase solida 11C-Metilazione, purificazione e formulazione per la produzione di traccianti PET

Riepilogo

Riportiamo un'efficiente tecnica di radioetichettatura del carbonio-11 per produrre traccianti clinicamente rilevanti per la tomografia a emissione di Positron (PET) utilizzando cartucce di estrazione in fase solida. ^{11 Del} sistema di L'agente c-metilante viene passato attraverso una cartuccia precaricata con precursore e l'eluizione successiva con etanolo acquoso fornisce traccianti PET chimicamente e radiochimicamente puri in alti rese radiochimiche.

Abstract

La produzione di routine di radiotracciatori utilizzati nella tomografia a emissione di positroni (PET) si basa principalmente sulla chimica umida in cui il synthon radioattivo reagisce con un precursore non radioattivo nella soluzione. Questo approccio richiede la purificazione del tracciante dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) seguita dalla riformulazione in un solvente biocompatibile per l'amministrazione umana. Recentemente abbiamo sviluppato un nuovo approccio a ^{metilazione a 11}C per la sintesi altamente efficiente di prodotti radiofarmaceutici PET con etichettato carbonio 11, sfruttando le cartucce di fase solide come unità monouso "3-in-1" per la sintesi, la purificazione e riformulazione dei traccianti. Questo approccio evita l'uso di HPLC preparativo e riduce le perdite del tracciante nelle linee di trasferimento e a causa del decadimento radioattivo. Inoltre, la tecnica basata sulla cartuccia migliora l'affidabilità della sintesi, semplifica il processo di automazione e facilita la conformità ai requisiti GMP (Good Manufacturing Practice). Qui, dimostriamo questa tecnica sull'esempio di produzione di un composto B di Pittsburgh, tracciante PET (^[11C]PiB), un agente di imaging in vivo gold standard per placche amiloidi nel cervello umano.

Introduzione

La tomografia a emissione di positroni (PET) è una modalità di imaging molecolare che si basa sulla rilevazione del decadimento radioattivo di un isotopo attaccato a una molecola biologicamente attiva per consentire la visualizzazione in vivo di processi, segnali e trasformazioni biochimiche . Il carbonio-11 (t_1/2 x 20,3 min) è uno dei radioisotopi più comunemente utilizzati nel PET a causa della sua abbondanza in molecole organiche e della breve emivita che consente più amministrazioni tracciari nello stesso giorno allo stesso soggetto umano o animale e riduce il carico di radiazioni sui pazienti. Molti tracciari etichettati con questo isotopo sono utilizzati negli studi clinici e nella ricerca sanitaria di base per l'imaging PET in vivo di bersagli classici ed emergenti biologicamente rilevanti - [¹¹C]raclopride per i recettori D₂/ D_3, [¹¹C] PiB per placche amiloidi, [¹¹C]PBR28 per la proteina traslocatore - per citarne solo alcuni.

I traccianti PET con etichetta di carbonio 11 sono prevalentemente prodotti tramite ¹¹modelli c-metilazione di precursori non radioattivi contenenti -OH (alcol, fenolo e acido carboxil), -NH (amine e amide) o -SH (thiol). In breve, l'isotopo viene generato nell'obiettivo gassoso di un ciclotrone tramite una reazione nucleare ¹¹N^{11 11}nella forma chimica di [¹¹C]CO₂. Quest'ultimo viene poi convertito in iodide^dimetil ([¹¹C]CH₃I) tramite chimica umida (riduzione a [¹¹C]CH₃OH con LiAlH₄ seguita da disseta con HI)¹ o asciutto chimica (riduzione catalitica a [¹¹C]CH₄ seguita da iodinazione radicale con molecolare I₂)². [¹¹C] CH₃Posso quindi essere ulteriormente convertito nel triflate più reattivo ^{di 11}C-metil ([¹¹C]CH₃OTf) passandolo sopra una colonna triflate d'argento³. ^L'11C-metilazione viene quindi eseguita bollendo il gas radioattivo in una soluzione di precursore non radioattivo nel solvente organico o attraverso il più elegante metodo "loop" del solvente in cattività^4,5. Il ¹¹C-tracer viene quindi purificato per mezzo di HPLC, riformulato in un solvente biocompatibile e passato attraverso un filtro sterile prima di essere somministrato a soggetti umani. Tutte queste manipolazioni devono essere veloci e affidabili data l'emivita breve del carbonio-11. Tuttavia, l'uso di un sistema HPLC aumenta significativamente le perdite del tracciante e del tempo di produzione, spesso richiede l'uso di solventi tossici, complica l'automazione e talvolta porta a sintesi fallite. Inoltre, la pulizia necessaria dei reattori e della colonna HPLC prolunga i ritardi tra le sintesi dei successivi lotti traccianti e aumenta l'esposizione del personale alle radiazioni.

La radiochimica del fluoro-18 (t_1/2 - 109,7 min), l'altro isotopo PET ampiamente utilizzato, è stata recentemente avanzata attraverso lo sviluppo di kit basati su cassette che eliminano la necessità di purificazione dell'HPLC. Utilizzando cartucce di estrazione di fase solide (SPE), questi kit completamente usa e getta consentono la produzione di routine affidabile di ¹⁸F-tracciar, tra cui [¹⁸F]FDG,^[18F]FMISO, [¹⁸F]FMC e altri, con sintesi più breve riduzione del coinvolgimento del personale e manutenzione minima dell'apparecchiatura. Uno dei motivi per cui il carbonio-11 rimane un isotopo meno popolare nell'imaging PET è la mancanza di kit simili per la produzione di routine di ¹¹traccianti C. Il loro sviluppo migliorerebbe significativamente l'affidabilità sintetica, aumenterebbe le rese radiochimiche e semplificherebbe l'automazione e la manutenzione preventiva dei moduli di produzione.

I kit di produzione attualmente disponibili sfruttano le cartucce SPE poco costose e usa e getta al posto delle colonne HPLC per la separazione del radiotracer da isotopi radioattivi non reagiti, precursori di altri sottoprodotti radioattivi e non radioattivi. Idealmente, la reazione di radioetichettatura procede anche sulla stessa cartuccia; per esempio, la^[18F]fluoromalalazione del dimetilaminoetolo con gassoso [¹⁸F]CH₂BrF nella produzione di cancro alla prostata PET tracciar [¹⁸F]fluoromethylcolina si verifica su una cartuccia di resina cation-exchange ⁶. Anche se procedure simili per la radioetichettatura di diversi ¹¹traccianti C sulle cartucce sono state riportate^7,8 ed è diventato particolarmente potente per la radiosintesi di [¹¹C]colina⁹ e [¹¹C]methionina¹⁰, questi esempi rimangono limitati ai traccianti PET oncologici in cui la separazione dal precursore spesso non è necessaria. Recentemente abbiamo riferito lo sviluppo di^"[11C]kit" per la produzione di [¹¹C]CH₃I¹¹ e la successiva ¹¹C-metilazione, così come la solida sintesi sostenuta in fase¹² nei nostri sforzi per semplificare la produzione di routine di ¹¹traccianti C. In questo caso, vogliamo dimostrare il nostro progresso utilizzando l'esempio della radiosintesi solida supportata dalla fase di [¹¹C]PiB, un radiotracer per l'imaging A- che ha rivoluzionato il campo dell'imaging della malattia di Alzheimer (AD) quando è stato sviluppato per la prima volta nel 2003 ( Figura 1) ^13,14. In questo metodo, il precursore volatile [¹¹C]CH₃OTf (bp 100) viene passato sopra il precursore 6-OH-BTA-0 depositato sulla resina di una cartuccia usa e getta. Il tracciante PET [¹¹C]PiB viene quindi separato dal precursore e dalle impurità radioattive per eluizione dalla cartuccia con etanolo acquoso biocompatibile. Inoltre, abbiamo automatizzato questo metodo di radiosintesi [¹¹C]PiB utilizzando un modulo di sintesi radiochimica azionato a distanza e kit di cassette usa e getta. In particolare, abbiamo implementato questa radiosintesi su un modulo di radiochimica a 20 valvole, dotato di unità siringa (dispenser) che si adatta a siringa di plastica monouso standard da 20 mL, controller di flusso del gas, pompa a vuoto e misuratore. Grazie alla semplicità di questo metodo, siamo fiduciosi che possa essere modificato per la maggior parte dei sintetizzatori automatici disponibili in commercio, sia su cassetta che quelli dotati di valvole fisse. Questa tecnica solida supportata in fase facilita la conformità alla produzione [¹¹C]PiB con le normative GMP (Good Manufacturing Practice) e migliora l'affidabilità della sintesi. La tecnica qui descritta riduce anche la quantità di precursore necessaria per la radiosintesi, utilizza solo solventi biocompatibili "verdi" e diminuisce il tempo tra i lotti di produzione consecutivi.

Protocollo

1. Preparazione di tamponi ed eluenti

1. Sciogliere 2,72 g di triidrato di acetato di sodio in 100 mL di acqua per preparare la soluzione di acetato di sodio da 0,2 M (soluzione A).
2. Sciogliere 11,4 mL di acido acetico glaciale in 1 L di acqua per preparare la soluzione di acido acetico 0,2 M (soluzione B).
3. Unire 50 mL della soluzione A con 450 mL della soluzione B per preparare il buffer di acetato a pH 3.7 (buffer 1) in base al buffer reference center¹⁵. Verificare il pH del buffer con strisce pH o un misuratore di pH.
4. Unire 12,5 mL di etanolo assoluto con 87,5 mL di tampone 1 per rendere 12,5% soluzione EtOH aqueous (lavaggio 1) in una bottiglia da 100 mL.
5. Unire 15 mL di etanolo assoluto con 85 mL di tampone 1 per rendere il 15% acquosa soluzione EtOH (lavaggio 2) in una bottiglia da 100 mL.
6. Combinare 5 mL di etanolo assoluto con 5 mL di buffer 1 per fare 50% soluzione EtOH acquosa (eluente finale) e disegnare 2,5 mL di questa soluzione in una siringa da 10 mL.

2. Applicazione del precursore della cartuccia

1. Passare 10 mL di acqua seguita da 5 mL di acetone attraverso la cartuccia tC18 per precondizionarlo.
2. Asciugare la cartuccia con un flusso di azoto a 50 mL/min per 1 min.
3. Sciogliere 2 mg del precursore 6-OH-BTA-0 in 1 mL di anhydrous acetone.
4. Tenendo una siringa di vetro di precisione Luer da 250 gradi verso il basso, ritirare 100 l della soluzione precursore e 50 l di cuscinetto d'aria sulla parte superiore del liquido. Rimuovere l'ago e applicare la soluzione precursore sulla cartuccia tC18 dall'estremità femminile spingendo lentamente lo stantuffo fino in fondo. Non spingere ulteriormente la soluzione!

3. Impostazione del collettore per la sintesi automatica

1. Fissare il collettore monouso standard a 5 porte sul modulo di sintesi e assemblarlo secondo la Figura 2 e i passaggi 3.2 - 3.5 riportati di seguito.
   NOTA: Si consiglia di utilizzare collettore resistente agli acetone (vedere Tabella dei materiali).
2. La porta 1 ha due posizioni. Collegare l'inboccino orizzontale all'erogatore automatico dotato di una siringa da 20 mL. Collegare l'ingresso verticale alla bottiglia con il lavaggio 1.
3. Collegare l'uscita del modulo che produce [¹¹C]CH₃OTf alla porta 2 del collettore.
4. Installare la cartuccia tC18 caricata con il precursore 6-OH-BTA-0 tra le porte 3 e 4.
5. La porta 5 ha due posizioni. Collegare la presa orizzontale alla bottiglia di scarto che deve contenere almeno 200 mL. Collegare la presa verticale alla fiala sterile per la raccolta tracer tramite il filtro sterile.

4. Radiosintesi di [¹¹C]PiB

AGGIORNAMENTO: Tutte le manipolazioni che coinvolgono isotopi radioattivi devono essere eseguite in una cella calda schermata dal piombo da personale con un addestramento adeguato per lavorare con materiali radioattivi.
NOTA: Questo protocollo non copre i dettagli della produzione di [¹¹C]CO₂ nel ciclotrone e la sua conversione in [¹¹C]CH₃OTf utilizzando il modulo di radiochimica. Queste procedure dipenderanno dalle singole apparecchiature del laboratorio di radiochimica e esulano dall'ambito di questo protocollo. Il nostro centro PET è dotato di un ciclotrone IBA, che produce carbonio-11 sotto forma chimica di [¹¹C]CO₂attraverso la reazione nucleare ¹⁴N(p,z)¹¹C con una miscela di gas N₂/O₂ (99.5:0.5) nel gas un modulo disponibile in commercio per la produzione di [¹¹C]CH₃I attraverso il "metodo secco" (riduzione catalitica a [¹¹C]CH₄ seguito da iodinazione radicale). [¹¹C] CH₃OTf è prodotto passando [¹¹C]CH₃I su una colonna triflate d'argento riscaldata a 175 gradi centigradi a 20 mL/min.

1. Consegnare [¹¹C]CH₃OTf nel collettore attraverso la porta 2 e passarlo attraverso la cartuccia tC18 caricata a 20 mL/min flusso di uscita regolato dal modulo [¹¹C]CH₃OTf, tramite le porte 3 e 4 e nella bottiglia di scarto come mostrato Figura 2A.
2. Una volta che tutta la radioattività è stata trasferita e intrappolata sulla cartuccia tC18 come monitorato dal rilevatore di radioattività dietro il supporto della cartuccia, arrestare il flusso di gas chiudendo la porta 2. Lasciare che la cartuccia si sieda per 2 minuti per completare la reazione.
3. Ritirare 19 mL di soluzione di lavaggio 1 (vedere il punto 1.4) dalla bottiglia da 100 mL nella siringa del distributore attraverso la porta 1 a 100 mL/min come mostrato nella Figura 2B.
4. Distribuisce 18,5 mL di soluzione di lavaggio 1 dal distributore attraverso la cartuccia tC18 tramite le porte 3 e 4 e nella bottiglia di scarto a 50 mL/min come mostrato nella Figura 2C. Assicurarsi l'assenza di bolle d'aria nel collettore in quanto potrebbero diminuire l'efficienza di separazione.
5. Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 quattro volte, ritirando e erogando 18,5 mL di soluzione di lavaggio 1. Il volume totale della soluzione di lavaggio 1 passato attraverso tC18 è di 92,5 mL; tuttavia, può variare all'interno della gamma 90 - 100 mL a seconda del particolare modulo di sintesi utilizzato.
6. Accendere la linea di ingresso sulla porta 1 dal lavaggio 1 alla soluzione di lavaggio 2 (vedere il passaggio 1.5).
7. Ripetere i passaggi 4.3 e 4.4 tre volte, ritirando e erogare 18,5 mL di soluzione 2 lavaggio. Il volume totale della soluzione di lavaggio 2 passato attraverso tC18 è 55,5 mL. Tuttavia, può variare all'interno della gamma 50 - 60 mL a seconda del particolare modulo di sintesi utilizzato.
8. Passare la valvola 5 verso la fiala finale, come illustrato nella figura 2D. Scollegare la linea dal dispenser e collegarla alla siringa da 10 mL contenente 2,5 mL della soluzione finale (50% acquosa EtOH, vedere il passaggio 1.6) e 7,5 mL di aria.
9. Tenendo la siringa verso il basso, spingere manualmente la soluzione finale eluente (2,5 mL) seguita dall'aria (7,5 mL) attraverso la cartuccia tC18 tramite le porte 3 e 4 e nella fiala sterile per la raccolta del tracciante tramite il filtro sterile, come mostrato nella figura 2D.
10. Scollegare la siringa vuota, collegare la siringa da 10 mL contenente 10 mL del buffer sterile di fosfato (ricetta non inclusa in quanto può variare) e spingere l'intero volume attraverso la cartuccia tC18 nella fiala sterile come descritto sopra (Figura 2D ). Scollegare la siringa e lavare la linea con 10 mL di aria utilizzando la stessa siringa.
11. Ritirare 0,7 mL della formulazione finale del tracciante e raccogliere campioni per le procedure di controllo qualità (0,1 mL), il test dell'endotossina batterica (0,1 mL) e la sterilità (0,5 mL).

5. Procedure di controllo della qualità

AVVISO: ogni lotto del radiotracer deve essere sottoposto alle procedure di controllo qualità (QC) appropriate prima del rilascio al sito di imaging PET per la somministrazione in soggetti umani o animali. Gli autori di questo manoscritto non sono responsabili per la conformità del radiotracer prodotto in altri centri con le normative delle autorità sanitarie locali.

1. Eseguire procedure di Controllo qualità pre-rilascio, che devono includere test per l'identità radiochimica (RCI), la purezza radiochimica (RCP), la purezza chimica e l'attività molare del tracciante, nonché il contenuto di solvente residuo e il pH della formulazione.
2. Determinare l'RCI, RCP, la purezza chimica e l'attività molare mediante sistemi HPLC analitici dotati di rilevatori UV (monitoraggio a 350 nm) e radioattività e una colonna di fase invertita. Determinare i tempi di conservazione di 6-OH-BTA-0 e 6-OH-BTA-1 e calibrare lo strumento per quantificare il contenuto di ogni composto.
3. Determinare il contenuto di solvente residuo mediante un sistema di cromatografia a gas analitico dotato di una colonna capillare. Determinare i tempi di ritenzione di acetone ed etanolo e calibrare lo strumento per quantificare il contenuto di ciascun solvente.
4. Eseguire il test delle endotossine batteriche utilizzando un lettore di cartucce dotato di cartucce adatte.
5. Eseguire l'analisi della sterilità del campione almeno 14 giorni dopo la sintesi per garantire l'assenza di crescita batterica o inviare il campione di sterilità a un laboratorio accreditato dall'autorità sanitaria locale.

Risultati

Per riassumere una tipica radiosintesi di [¹¹C]PiB, il gassoso [¹¹C]CH₃OTf viene prima passato attraverso una cartuccia tC18 precaricata con una soluzione di precursore (Figura 1). La separazione della miscela di reazione viene quindi ottenuta mediante eluizione successiva con soluzioni etanolo acquose come segue. In primo luogo, il 12,5% di EtOH eluisce la maggior parte dei non reagiti [¹¹C]CH₃OTf e 6-OH...

Discussione

Nonostante la recente comparsa e l'approvazione FDA di diversi traccianti PET etichettati da ¹⁸F, come florbetapir, florbetaben e flutemetamolo, [¹¹C]PiB rimane un tracciante standard d'oro per l'imaging amiloide a causa della rapida assunzione del cervello e rilegatura. Attualmente questo tracciante è sintetizzato tramite chimica bagnata¹⁶ o utilizzando un approccio "ciclo secco"^4,17. Entrambi i metodi rich...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-OH-BTA-0	ABX advanced biochemical compounds	5101	Non-radioactive precursor of [11C]PiB
6-OH-BTA-1	ABX advanced biochemical compounds	5140	Non-radioactive standard of [11C]PiB
Agilent 1200 HPLC system	Agilent	Agilent 1200	Analytical HPLC system
Ethanol absolute	Commercial alcohols	432526
Hamilton syringe (luer-tip, 250 µL)	Hamilton	HAM80701
MZ Analytical PerfectSil 120	MZ-Analysentechik GmbH	MZ1440-100040	Analytical HPLC column
Perkin Elmer Clarus 480 GC system	Perkin Elmer	Clarus 480	Gas chromotograph
polycarbonate manifold	Scintomics	ACC-101	Synthesis manifold
Restek MTX-Wax column (30 m, 0.53 mm)	Restek	70625-273	Analytical GC column
Scintomics GRP module	Scintomics	Scintomics GRP	Automated synthesis unit
Sep-Pak tC18 Plus	Waters	WAT020515	Solid phase extraction cartridge
solvent-resistant manifold	Scintomics	ACC-201	Synthesis manifold
Spinal needle	BD	405181
Sterile extension line	B. Braun	8255059
Sterile filter	Millipore	SLLG013SL
Sterile vial (20mL)	Huayi	SVV-20A
Sterile water	Baxter	JF7623
Synthra MeIplus Research	Synthra	MeIplus Research	[11C]CH3I/[11C]CH3OTf module
Syringe (10 mL)	BD	309604
Syringe (1mL)	BD	309659
Syringe (20 mL)	B. Braun	4617207V	Dispenser syringe
Vent filter	Millipore	TEFG02525