Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
在这里,提出了一个协议,以生产和后CRISPR/Cas9基因组敲除电鱼。详细列出了运动和生物形态所需的分子生物学、育种和饲养要求,以及生产 Cas9 诱导 Indel F0幼虫的注射技术。
在脊椎动物的进化史上,电接收和电发生已经发生了变化。这些独立衍生的表型具有惊人的收敛性,它们有着共同的遗传结构。这也许最好的例证是健身房和莫米里德的众多收敛特征,这两种物种丰富的电镀层能够产生和检测弱电场,被称为弱电鱼。自从发现弱电鱼用电来感知周围环境和交流以来的50年里,越来越多的科学家对发展、系统和电路神经科学的演变有了巨大的见解,细胞生理学、生态学、进化生物学和行为学。最近,电鱼的基因组资源激增。这些资源的使用已经促进了对这些物种基因型和表型之间联系的重要见解。将基因组学数据与弱电鱼表型数据集成的一个主要障碍是目前缺乏功能基因组学工具。我们在这里报告一个完整的协议,执行CRISPR/Cas9诱变,利用内源性DNA修复机制在弱电鱼。我们证明,该协议在莫米里德物种布诺米鲁斯小虫和健身房,通过使用CRISPR/Cas9来靶向第一个外显子中的印贝和点突变,同样有效。钠通道基因scn4aa。使用该协议,从两个物种获得胚胎和基因型,以确认在钠通道scn4aa的第一个外向的预测突变存在。与未注射大小匹配的对照组相比,记录显示电器官放电振幅降低,证实了敲除成功的表型。
在脊椎动物的进化史上,电接收和电发生已经发生了变化。两个谱系的远发鱼,骨状和硅状,平行地进化电接收,和五个谱系的远程(金体素,莫米里德,和属星体,马拉普特鲁鲁斯,和西诺多特斯)并联进化电发生。这些独立衍生的表型具有惊人的收敛性,它们共享着一个共同的遗传结构1,2,3。
这也许最好的例证是,健身房和莫米里德的众多收敛特征,这两个物种丰富的电镀层,产生和检测弱电场,被称为弱电鱼。在发现弱电鱼利用电来感知周围环境和交流的50年里,越来越多的科学家对发展的演变有了巨大的了解。 ,6, 系统和电路神经科学7,8,9,10,细胞生理学
Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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