Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Her præsenteres en protokol for at producere og bageste crispr/Cas9 genom knockout elektrisk fisk. Detaljeret beskrevet er de nødvendige molekylær biologi, avl og opdræts krav for både en gymnotiform og en mormyrid, og injektion teknikker til at producere Cas9-induceret Indel F0 larver.
Electroreception og electrogenesis har ændret sig i den evolutionære historie af hvirveldyr. Der er en slående grad af konvergens i disse selvstændigt afledte fænotyper, som deler en fælles genetisk arkitektur. Dette er måske bedst eksemplificeret ved de talrige konvergerende funktioner i gymnotiforms og mormyrids, to artsrige teleost clader, der producerer og detekterer svage elektriske felter og kaldes svagt elektriske fisk. I 50 år siden opdagelsen af, at svagt elektriske fisk bruger elektricitet til at fornemme deres omgivelser og kommunikere, et voksende samfund af videnskabsfolk har fået enorm indsigt i udviklingen af udvikling, systemer og kredsløb neurovidenskab, cellulære fysiologi, økologi, evolutionær biologi, og opførsel. For nylig har der været en spredning af genomressourcerne til elektriske fisk. Brugen af disse ressourcer har allerede lettet vigtig indsigt med hensyn til forbindelsen mellem genotype og fænotype hos disse arter. En væsentlig hindring for at integrere genomforskning-data med fænotypiske data om svagt elektriske fisk er en nuværende mangel på funktionelle genomforskning-værktøjer. Vi rapporterer her en fuld protokol for at udføre CRISPR/Cas9 mutagenese, der udnytter endogene DNA reparationsmekanismer i svagt elektriske fisk. Vi viser, at denne protokol er lige så effektiv i både mormyrid-arterne Brienomyrus brachyistius og gymnotiformen Brachyhypopomus gauderio ved at bruge crispr/Cas9 til at målrette indels og punktmutationer i den første exon af natrium kanalen gen scn4aa. Ved hjælp af denne protokol blev embryoner fra begge arter fremstillet og Geno skrevet for at bekræfte, at de forventede mutationer i den første exon af natrium kanalen scn4aa var til stede. Knock-out succes fænotype blev bekræftet med optagelser viser reduceret elektrisk organ udledning amplituder sammenlignet med uinjiceret størrelse-matchede kontrol.
Electroreception og electrogenesis har ændret sig i den evolutionære historie af hvirveldyr. To nedstamningens af teleost fisk, osteoglossiformes og Siluriformes, udviklet electroreception parallelt, og fem nedstamningens af teleoster (gymnotiformes, mormyrids, og slof astroscopus, malapterurus, og Synodontis) udviklet electrogenesis parallelt. Der er en slående grad af konvergens i disse selvstændigt afledte fænotyper, som deler en fælles genetisk arkitektur1,2,3.
Dette er måske bedst eksemplificeret ved de talrige konve....
Alle metoder, der er beskrevet her, er blevet godkendt af det institutionelle udvalg for dyrepasning og-brug (IACUC) på Michigan State University.
1. valg af sgRNA-mål
Bemærk: Der findes en protokol til manuel design af sgRNAs i trin 1,1. Dette blev udnyttet til scn4aa Target udvælgelse. Der gives en tillægsprotokol for at lette denne proces (trin 1,2) ved hjælp af webportalen EFISHGENOMICS. Det tilrådes, at brugerne vælger protokol 1.......
SgRNA-målstederne blev identificeret inden for exon 1 af scn4aa i både b. Gauderio og b. brachyistius som beskrevet i afsnit 1. SgRNAs blev genereret som beskrevet i afsnit 2. Efter vellykket sgRNA-udvælgelse og-syntese (figur 1) blev in vitro-spaltning afprøvet (figur 2). SgRNAs, der demonstrerer in vitro-skæring, blev derefter udvalgt til mikroinjektioner med enkelt celle.
Voksne fisk var konditionere.......
Den fænotypiske rigdom af svagt elektriske fisk, sammen med en nylig spredning af genomforskning ressourcer, motiverer et stærkt behov for funktionelle genomiske værktøjer i svagt elektrisk fisk model. Dette system er særligt attraktivt på grund af den konvergerende udvikling af talrige fænotypiske træk i parallelle nedstamningens af fisk, som let holdes i laboratoriet.
Den protokol, der er beskrevet her, viser effekten af crispr/Cas9-teknikken i nedstamningens af svagt elektriske fisk.......
Forfatterne anerkender den heroiske indsats af Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, og Hope Healey for at få hjælp til fiskeopdræt, dataindsamling og tidlig protokol udvikling. Vi vil også gerne takke de tre anmeldere for deres forslag til manuskriptet. Vi mener, at det endelige produkt er af bedre kvalitet efter at have rettet deres kommentarer. Dette arbejde blev finansieret af støtte fra National Science Foundation #1644965 og #1455405 til JRG, og Generaldirektoratet for naturvidenskab og ingeniør forskning giver VLS.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved