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Biology

Den Funken zum Schweigen bringen: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Published: October 27th, 2019

DOI:

10.3791/60253

1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Hier wird ein Protokoll zur Herstellung und Hinten von CRISPR/Cas9 Genom-Knockout-Elektrofischen vorgestellt. Im Detail beschrieben sind die erforderlichen Molekularbiologie-, Zucht- und Haltungsanforderungen für eine Gymnotiform und ein Mormyrid sowie Injektionstechniken zur Herstellung von Cas9-induzierten Indel F0 Larven.

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Es gibt einen bemerkenswerten Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetische Architektur teilen. Dies wird vielleicht am besten durch die zahlreichen konvergenten Merkmale von Gymnotiformen und Mormyriden veranschaulicht, zwei artenreichen Teleostklades, die schwache elektrische Felder produzieren und erkennen und schwach elektrischer Fisch genannt werden. In den 50 Jahren seit der Entdeckung, dass schwach elektrische Fische Elektrizität nutzen, um ihre Umgebung zu spüren und zu kommunizieren, hat eine wachsende Gemeinschaft von Wissenschaftlern enorme Einblicke in die Entwicklung der Entwicklung, Systeme und Schaltkreise Neurowissenschaften gewonnen, Zellphysiologie, Ökologie, Evolutionsbiologie und Verhalten. In jüngerer Zeit hat es eine Vermehrung genomischer Ressourcen für elektrische Fische gegeben. Die Nutzung dieser Ressourcen hat bereits wichtige Erkenntnisse in Bezug auf den Zusammenhang zwischen Genotyp und Phänotyp bei diesen Arten ermöglicht. Ein großes Hindernis für die Integration von Genomdaten mit phänotischen Daten schwach elektrischer Fische ist ein gegenwärtiger Mangel an funktionellen Genomik-Tools. Wir berichten hier über ein vollständiges Protokoll zur Durchführung der CRISPR/Cas9-Mutagenese, das endogene DNA-Reparaturmechanismen in schwach elektrischen Fischen nutzt. Wir zeigen, dass dieses Protokoll sowohl bei der mormyriden Art Brienomyrus brachyistius als auch bei der Gymnotiform Brachyhypopomus gauderio gleichermaßen wirksam ist, indem wir CRISPR/Cas9 verwenden, um Indels und Punktmutationen im ersten Exon des Natriumkanalgen scn4aa. Mit diesem Protokoll wurden Embryonen beider Arten gewonnen und genotypisiert, um zu bestätigen, dass die vorhergesagten Mutationen im ersten Exon des Natriumkanals Scn4aa vorhanden waren. Der Knock-out-Erfolg-Phänotyp wurde mit Aufnahmen bestätigt, die reduzierte elektrische Organentladungsamplituden im Vergleich zu nicht injizierten größenangepassten Kontrollen zeigten.

Elektroempfang und Elektrogenese haben sich in der Evolutionsgeschichte der Wirbeltiere verändert. Zwei Linien von Teleostfischen, Osteoglossiformen und Siluriformen, entwickelten parallel den Elektroempfang und fünf Linien von Teleosten (Gymnotiformes, Mormyriden und die Gattungen Astroscopus, Malapterurus und Synodontis) Elektrogenese parallel entwickelt. Es gibt einen auffälligen Grad an Konvergenz in diesen unabhängig abgeleiteten Phänotypen, die eine gemeinsame genetischeArchitektur1,2,3.

Dies lässt sich vielleicht a....

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Michigan State University genehmigt.

1. Auswahl von sgRNA-Zielen

HINWEIS: Für die manuelle Gestaltung von sgRNAs in Schritt 1.1 wird ein Protokoll bereitgestellt. Dies wurde für die scn4aa-Zielauswahl verwendet. Um diesen Prozess (Schritt 1.2) über das EFISHGENOMICS-Webportal zu erleichtern, wird ein zusätzliches Protokoll bereitgestellt. E.......

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Die sgRNA-Zielstandorte wurden innerhalb von Exon 1 von Scn4aa sowohl in B. gauderio als auch in B. brachyistius identifiziert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. Die sgRNAs wurden wie in Abschnitt 2 beschrieben generiert. Nach erfolgreicher sgRNA-Auswahl und -Synthese (Abbildung 1) wurde die In-vitro-Spaltung getestet (Abbildung 2). Die sgRNAs, die In-vitro-Schneiden demonstrieren, wurden dann für einzellige Mikroinjektionen ausgewählt.......

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Der phänoseische Reichtum schwach elektrischer Fische, zusammen mit einer kürzlichen Verbreitung von Genomressourcen, motiviert einen starken Bedarf an funktionellen Genomwerkzeugen im schwach elektrischen Fischmodell. Dieses System ist besonders attraktiv wegen der konvergenten Entwicklung zahlreicher phänotypischer Merkmale in parallelen Fischlinien, die leicht im Labor gehalten werden können.

Das hier beschriebene Protokoll zeigt die Wirksamkeit der CRISPR/Cas9-Technik in Linien schwach.......

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Die Autoren würdigen die heldenhaften Bemühungen von Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud und Hope Healey um Hilfe bei der Fischzucht, der Datensammlung und der frühen Protokollentwicklung. Wir möchten auch den drei Rezensenten für ihre Vorschläge zum Manuskript danken. Wir glauben, dass das Endprodukt von besserer Qualität ist, nachdem sie ihre Kommentare angesprochen haben. Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der National Science Foundation #1644965 und #1455405 an JRG und die Stiftung Naturwissenschaften und Ingenieurforschung AN VLS finanziert.

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
20 mg/mL RNA grade GlycogenThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
borosilicate glass capillary with filamentSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Tissue KitQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroinjectorFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsFisher Scientific10289651
Hamilton syringeFisher Scientific14-824-654referred to as "precision glass syringe" in the protocol
KimwipeFisher Scientific06-666referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sused for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlreferred to as "spawning agent" in the protocol
ParafilmFisher ScientificS37440referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette pullerWPISU-P97sutter brand
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Reusable needle- requires customizationFisher Scientific7803-02Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymeraseNEBM0203LUse with the 10X NEB buffer that is included
Teflon coated toolsbonefolder.comT-SPATULA4PIECEreferred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

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