JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

השתקה הניצוץ: CRISPR/Cas9 הגנום עריכה בדגים חשמליים חלש

Published: October 27th, 2019

DOI:

10.3791/60253

1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

כאן, פרוטוקול מוצג לייצר והאחורי CRISPR/Cas9 הגנום מנוקאאוט דגים חשמליים. מפורטים בפירוט הינם דרישות הביולוגיה המולקולרית, הרבייה והטיפול בשני הצדדים, ובטכניקות הזרקה ושיטות הזרקת הCas9 המושרה ביותר.

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת. זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של צורות הג ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades כי לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגים חשמליים חלש. בשנים 50 מאז התגלית כי הדגים החשמליים חלש להשתמש בחשמל כדי לחוש את סביבתם ולתקשר, קהילה גוברת של מדענים צברה תובנות עצומות להתפתחות של פיתוח, מערכות ומעגלים מדעי המוח, פיזיולוגיה של הסלולר, אקולוגיה, ביולוגיה אבולוציונית והתנהגות. לאחרונה, יש התפשטות של משאבים גנומית עבור דגים חשמליים. השימוש במשאבים אלה כבר הנחה תובנות חשובות לגבי הקשר בין הגנוטיפ לבין הפנוטיפים במינים אלה. מכשול גדול לשילוב נתונים גנומיקה עם נתונים פנוטים של דגים חשמליים חלש הוא העדר הנוכחי של כלי גנומיקה תפקודית. אנו מדווחים כאן פרוטוקול מלא לביצוע CRISPR/Cas9 מוטגנזה אשר מנצל מנגנוני תיקון DNA אנדוגניים בדגים חשמליים חלש. אנו מדגימים כי פרוטוקול זה הוא יעיל באותה מידה הן מיני מורגמיל ברינורוס ברכימיטיוס ואת הטופס המסוןברכימוטציות gauderio באמצעות Crispr/Cas9 כדי למקד את indels ואת הנקודה המוטציות באקסון הראשון של ערוץ הנתרן גן scn4aa. באמצעות פרוטוקול זה, עוברים משני המינים הושגו והוקלדה על מנת לאשר כי המוטציות החזוי ב הראשון של ערוץ הנתרן scn4aa היו נוכחים. הצלחת להוריד את ההצלחה פנוטיפ היה אישר עם הקלטות מראה מופחת החוצה איבר חשמלי הפחתת המוני כאשר לעומת שולטת בגודל לא מוזרק התאמה.

הגשלות האלקטורלוגיה ואלקטרוגנזה השתנו בהיסטוריה האבולוציונית של החוליות. שני מדורות של דגי teleost, אוסטוריאים וסילאואים, התפתחו התפשלות חשמלית במקביל, וחמש שנות שילוח (ממוראים, מוררידים, וכללי אסטרוסקופוס, מאלאפטראורוס וסינודונטיס) התפתחו אלקטרוגנזה במקביל. יש מידה מרשימה של התכנסות אלה פנוטיפים נגזר באופן עצמאי, אשר חולקים ארכיטקטורה גנטית משותפת1,2,3.

זה אולי הטוב ביותר לידי ביטוי על ידי התכונות הרבות מתכנסת של טפסי ממורשים ו mormyrids, שני מינים עשירים teleost clades, אשר לייצר ולזהות שדות חשמליים חלשים והם נקראים דגי....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים (IACUC) של אוניברסיטת מדינת מישיגן.

1. בחירת יעדי sgRNA

הערה: פרוטוקול מסופק לעיצוב ידני של sgRNAs בשלב 1.1. זה היה מנוצל לבחירת היעד scn4aa . פרוטוקול נוסף מסופק כדי להקל על תהליך זה (שלב 1.2) בא?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

אתרי היעד sgrna זוהו בתוך אקסון 1 של scn4aa בשני ב. gauderio ו -b. ברכסינטיוס כפי שמתואר בסעיף 1. SgRNAs נוצרו כמתואר בסעיף 2. בעקבות בחירה מוצלחת sgRNA וסינתזה (איור 1), במחשוף מבחנה נבדק (איור 2). SgRNAs הפגינו חיתוך מחוץ לכאן נבחרו לאחר מכן עבור מיקרוזריקות תא בודד........

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העושר פנוטילי של דג חשמלי חלש, יחד עם התפשטות האחרונות של משאבי גנומיקה, מניע צורך חזק עבור כלים גנוטים פונקציונלי במודל של דגים חשמליים חלש. מערכת זו היא אטרקטיבית במיוחד בשל האבולוציה מתכנסת של תכונות פנויואיות רבות בתוך ליננים מקבילים של דגים, אשר נשמרים בקלות במעבדה.

הפ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המחברים מכירים את המאמצים ההרואיים של מוניקה לוקאס, קת'רין שאו, ריאן טיילור, ג'ארד תומפסון, ניקול רוביצ'ד, ותקווה הילי לעזרה עם גידול דגים, איסוף נתונים, ופיתוח פרוטוקולים מוקדם. כמו כן, אנו רוצים להודות לשלושת הבודקים על הצעותיהם לכתב היד. אנו מאמינים שהמוצר הסופי יהיה באיכות טובה יותר לאחר התייחסות לערותיהם. עבודה זו ממומנת על ידי תמיכה של הקרן הלאומית למדע #1644965 ו#1455405 ל-JRG, ואת מדעי הטבע ומועצת המחקר ההנדסה DG מעניקים VLS.

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
20 mg/mL RNA grade GlycogenThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
borosilicate glass capillary with filamentSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Tissue KitQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroinjectorFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsFisher Scientific10289651
Hamilton syringeFisher Scientific14-824-654referred to as "precision glass syringe" in the protocol
KimwipeFisher Scientific06-666referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sused for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlreferred to as "spawning agent" in the protocol
ParafilmFisher ScientificS37440referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette pullerWPISU-P97sutter brand
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Reusable needle- requires customizationFisher Scientific7803-02Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymeraseNEBM0203LUse with the 10X NEB buffer that is included
Teflon coated toolsbonefolder.comT-SPATULA4PIECEreferred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

  1. Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
  2. Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
  3. Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system--twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
  4. Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
  5. Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
  6. Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
  7. Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
  8. Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
  9. Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
  10. Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
  11. Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
  12. Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
  13. Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
  14. Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
  15. Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
  16. Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
  17. Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
  18. Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
  19. Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
  20. Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
  21. Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
  22. Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
  23. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
  24. Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
  25. Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
  26. Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
  27. Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
  28. Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
  29. Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
  30. Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
  31. Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
  32. Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
  33. Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
  34. Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
  35. Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
  36. Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
  37. Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
  38. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
  39. Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
  40. Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
  41. Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Developmental Biology. 445 (2), 156-162 (2019).
  42. Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Developmental Biology. 393 (1), 3-9 (2014).
  43. Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist's Practical Guide to CRISPR Applications. Genetics. 199 (1), 1-15 (2015).
  44. Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
  45. van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
  46. Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
  47. Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
  48. Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
  49. Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
  50. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
  51. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
  52. Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
  53. Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
  54. Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
  55. Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
  56. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
  57. Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
  58. Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
  59. Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
  60. Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved