Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
यहाँ, एक प्रोटोकॉल का उत्पादन और CRISPR/Cas9 जीनोम नॉकआउट बिजली मछली के पीछे प्रस्तुत किया है. विस्तार से उल्लिखित दोनों एक gymnotiform और एक mormyrid के लिए आवश्यक आणविक जीव विज्ञान, प्रजनन, और पशुपालन आवश्यकताओं, और इंजेक्शन तकनीक Cas9 प्रेरित indel एफ0 लार्वा का उत्पादन कर रहे हैं.
कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न phenotypes, जो एक आम आनुवंशिक वास्तुकला का हिस्सा में अभिसरण के एक हड़ताली डिग्री है. यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids के कई अभिसरण सुविधाओं द्वारा उदाहरण है, दो प्रजातियों अमीर teleost clades कि उत्पादन और कमजोर बिजली के क्षेत्रों का पता लगाने और कमजोर बिजली मछली कहा जाता है. खोज के बाद से 50 वर्षों में है कि कमजोर बिजली मछली बिजली का उपयोग करने के लिए अपने परिवेश भावना और संवाद, वैज्ञानिकों की एक बढ़ती समुदाय के विकास में जबरदस्त अंतर्दृष्टि प्राप्त की है, सिस्टम और सर्किट तंत्रिका विज्ञान, सेलुलर शरीर क्रिया विज्ञान, पारिस्थितिकी, विकासवादी जीव विज्ञान, और व्यवहार. हाल ही में, वहाँ बिजली की मछली के लिए जीनोमिक संसाधनों का प्रसार किया गया है. इन संसाधनों का उपयोग पहले से ही इन प्रजातियों में जीनोटाइप और phenotype के बीच संबंध के साथ महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि की सुविधा है. कमजोर बिजली मछली के phenotypic डेटा के साथ जीनोमिक्स डेटा को एकीकृत करने के लिए एक प्रमुख बाधा कार्यात्मक जीनोमिक्स उपकरण ों की एक वर्तमान कमी है. हम यहाँ CRISPR/Cas9 mutagenesis कि कमजोर बिजली की मछली में अंतर्जात डीएनए मरम्मत तंत्र का इस्तेमाल प्रदर्शन के लिए एक पूर्ण प्रोटोकॉल रिपोर्ट. हम प्रदर्शित करते हैं कि इस प्रोटोकॉल दोनों mormyrid प्रजातियों Brienomyrus ब्रैकीइस्टियस और gymnotiform Brachyhypopomus gauderio में समान रूप से प्रभावी है CRISPR/Cas9 का उपयोग करके indels और बिंदु उत्परिवर्तनों को लक्षित करने के लिए के पहले exon सोडियम चैनल जीन scn4aa| इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, दोनों प्रजातियों के भ्रूण प्राप्त किए गए थे और यह पुष्टि करने के लिए जीनोटाइप किए गए थे कि सोडियम चैनल scn4aa के पहले एक्सऑन में अनुमानित उत्परिवर्तन मौजूद थे। नॉक आउट सफलता phenotype कम बिजली अंग निर्वहन आयाम दिखा रिकॉर्डिंग के साथ पुष्टि की थी जब इंजेक्शन आकार मिलान नियंत्रण की तुलना में.
कशेरुकियों के विकासवादी इतिहास में विद्युत अभिग्रहण और विद्युतजनन बदल गया है। टेलीओस्ट मछली के दो वंश, ऑस्टियोग्लोसिफॉर्मीज और siluriformes, समानांतर में विद्युत ग्रहण विकसित, और teleosts के पांच वंश (जिमनोटीफॉर्मीज, mormyrids, और वंश एस्ट्रोस्कॉपस, Malpterurus, और Synodontis) समानांतर में विकसित इलेक्ट्रोजेनेसिस. इन स्वतंत्र रूप से व्युत्पन्न फीनोटाइप में अभिसरण की एक उल्लेखनीय डिग्री है , जो एक सामान्य आनुवंशिक वास्तुकला1,2,3का हिस्सा है .
यह शायद सबसे अच्छा जिम्नोटिफॉर्म्स और mormyrids, दो प्रजातियों अमीर teleost clade....
SgRNA लक्ष्य साइटों दोनों बी gauderio और बी brachyistius में scn4aa के exon 1 के भीतर की पहचान की गई के रूप में धारा 1 में वर्णित. sgRNAs धारा 2 में वर्णित के रूप में उत्पन्न किए गए थे। सफल sgRNA चयन और संश्लेषण के बाद (चित्.......
कमजोर बिजली मछली की phenotypic समृद्धि, जीनोमिक्स संसाधनों के हाल ही में प्रसार के साथ, कमजोर बिजली मछली मॉडल में कार्यात्मक जीनोमिक उपकरणों के लिए एक मजबूत जरूरत को प्रेरित करती है. यह प्रणाली विशेष रूप से म?.......
लेखकों मोनिका लुकास, कैथरीन शॉ, रयान टेलर, जारेड थॉम्पसन, निकोल Robichaud, और आशा है कि Healey मछली पालन, डेटा संग्रह, और जल्दी प्रोटोकॉल विकास के साथ मदद के लिए वीर प्रयासों को स्वीकार करते हैं. हम पांडुलिपि के लिए अपने सुझावों के लिए तीन समीक्षकों को भी धन्यवाद देना चाहूंगा। हमें विश्वास है कि अंतिम उत्पाद उनकी टिप्पणी को संबोधित करने के बाद बेहतर गुणवत्ता का हो. इस काम के राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन #1644965 और जेआरजी के लिए #1455405 से समर्थन द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद वीएलएस के लिए डीजी अनुदान.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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