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Biology

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Published: October 27th, 2019

DOI:

10.3791/60253

1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

Qui viene presentato un protocollo per produrre e retrocedere il genoma CRISPR/Cas9 knockout pesce elettrico. In dettaglio sono indicati i requisiti di biologia molecolare, allevamento e allevamento necessari sia per una palestra che per un mormyrid, e tecniche di iniezione per produrre larve indeletta F0 indotte da Cas9.

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune. Questo è forse meglio esemplificato dalle numerose caratteristiche convergenti di gymnotiformi e mormyridi, due cladi teleosti ricchi di specie che producono e rilevano campi elettrici deboli e sono chiamati pesci debolmente elettrici. Nei 50 anni trascorsi dalla scoperta che i pesci debolmente elettrici usano l'elettricità per percepire l'ambiente circostante e comunicare, una comunità crescente di scienziati ha acquisito enormi informazioni sull'evoluzione dello sviluppo, dei sistemi e dei circuiti delle neuroscienze, fisiologia cellulare, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Più recentemente, c'è stata una proliferazione di risorse genomiche per i pesci elettrici. L'uso di queste risorse ha già facilitato importanti intuizioni per quanto riguarda la connessione tra genotipo e fenotipo in queste specie. Uno dei principali ostacoli all'integrazione dei dati genomici con i dati fenotipici dei pesci debolmente elettrici è una mancanza di strumenti genomici funzionali. Riportiamo qui un protocollo completo per l'esecuzione della mutagenesi CRISPR/Cas9 che utilizza meccanismi endogeni di riparazione del DNA nei pesci debolmente elettrici. Dimostriamo che questo protocollo è altrettanto efficace sia nella specie mormyrid Brienomyrus brachyistius che nella gymnotiforme Brachyhypopomus gauderio utilizzando CRISPR/Cas9 per colpire indels e mutazioni puntiformi nel primo esone del gene del canale di sodio scn4aa. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti embrioni di entrambe le specie e si sono genotiper per confermare che le mutazioni previste nel primo esone del canale di sodio scn4aa erano presenti. Il fenotipo di successo è stato confermato con registrazioni che mostrano una riduzione delle ampiezza di scarico dell'organo elettrico rispetto ai controlli non iniettati.

L'elettroricezione e l'elettrogenesi sono cambiate nella storia evolutiva dei vertebrati. Due lignaggi di pesce teleost, osteoglossiformes e siluri, hanno evoluto l'elettroricezione in parallelo, e cinque lignaggi di teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e il genere Astroscopus, Malapterurus e Synodontis) elettrogenesi evoluta in parallelo. C'è un notevole grado di convergenza in questi fenotipi derivati in modo indipendente, che condividono un'architettura genetica comune1,2,3.

Questo è forse meglio esemplificato dalle num....

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Michigan State University.

1. Selezione dei bersagli sgRNA

NOT: Nel passaggio 1.1 viene fornito un protocollo per la progettazione manuale degli sgRNA. Questo è stato utilizzato per la selezione del bersaglio scn4aa. Viene fornito un protocollo aggiuntivo per facilitare questo processo (passaggio 1.2) utilizzando il portale web EFI.......

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I siti di destinazione dello sgRNA sono stati identificati all'interno dell'esone 1 di scn4aa in B. gauderio e B. brachyistius come descritto nella Sezione 1. Gli sgRNA sono stati generati come descritto nella Sezione 2. A seguito del successo della selezione e della sintesi dello sgRNA (Figura 1), è stata testata la scissione in vitro (Figura 2). Gli sgRNA che dimostrano il taglio in vitro sono stati poi selezionati per le microiniez.......

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La ricchezza fenotipica dei pesci debolmente elettrici, insieme a una recente proliferazione delle risorse genomiche, motiva un forte bisogno di strumenti genomici funzionali nel modello di pesce debolmente elettrico. Questo sistema è particolarmente attraente a causa della convergente evoluzione di numerosi tratti fenotipici in linee parallele di pesci, che sono facilmente conservati in laboratorio.

Il protocollo qui descritto dimostra l'efficacia della tecnica CRISPR/Cas9 nei lignaggi di pe.......

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Gli autori riconoscono gli sforzi eroici di Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey per l'aiuto con l'allevamento dei pesci, la raccolta dei dati e lo sviluppo del protocollo iniziale. Vorremmo anche ringraziare i tre recensori per i loro suggerimenti al manoscritto. Crediamo che il prodotto finale sia di migliore qualità dopo aver affrontato i loro commenti. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno della National Science Foundation #1644965 e #1455405 al JRG, e dalla sovvenzione della DG del Consiglio per le Scienze Naturali e la Ricerca Ingegneria a VLS.

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NameCompanyCatalog NumberComments
20 mg/mL RNA grade GlycogenThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
borosilicate glass capillary with filamentSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Tissue KitQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroinjectorFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsFisher Scientific10289651
Hamilton syringeFisher Scientific14-824-654referred to as "precision glass syringe" in the protocol
KimwipeFisher Scientific06-666referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sused for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlreferred to as "spawning agent" in the protocol
ParafilmFisher ScientificS37440referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette pullerWPISU-P97sutter brand
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Reusable needle- requires customizationFisher Scientific7803-02Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymeraseNEBM0203LUse with the 10X NEB buffer that is included
Teflon coated toolsbonefolder.comT-SPATULA4PIECEreferred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

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