火花のサイレンシング:弱い電気魚のCRISPR/Cas9ゲノム編集

ここでは、CRISPR/Cas9ゲノムノックアウト電気魚を製造し、後部するためのプロトコルが提示される。詳細に概説するのは、ジムノチフォームとモルミリドの両方に必要な分子生物学、繁殖、および夫の要件、およびCas9誘発インデルF₀幼虫を産生するための注射技術である。

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。共通の遺伝的構造を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の収束があります。これはおそらく、ジムノチフォームとモルミリドの数多くの収束的な特徴、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれる2種豊富なテレオストクレードによって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、コミュニケーションをとっているという発見から50年の間に、科学者のコミュニティは、開発、システム、回路神経科学の進化に関する大きな洞察を得てきました。細胞生理学、生態学、進化生物学、行動最近では、電気魚のゲノム資源が急増しています。これらの資源の使用は、これらの種における遺伝子型と表現型との関連に関する重要な洞察を既に促進している。弱い電気魚のフェノチピックデータとゲノムデータを統合する際の大きな障害は、機能的なゲノムツールの欠けている現在の欠如である。ここでは、弱い電気魚の内因性DNA修復機構を利用したCRISPR/Cas9突然変異誘発を行うための完全なプロトコルを報告する。我々は、このプロトコルが、CRISPR/Cas9を使用して、最初のエキソンにおけるインデルと点突然変異を標的とすることにより、モルミリ種ブリジノミルス・ブラキシシステウスとジムノチフォーム・ブラキポポムス・ガウデリオの両方で等しく有効であることを実証する。ナトリウムチャネル遺伝子scn4aa.このプロトコルを用いて、両方の種から胚を得て、ナトリウムチャネルscn4aaの最初のエキソンに予測された突然変異が存在することを確認するために遺伝子型化された。ノックアウト成功表現型は、未注入のサイズ一致制御と比較した場合、電気器官放電振幅の低下を示す記録で確認された。

電気受容と電気発生は脊椎動物の進化史において変化した。テレオスト魚の2つの系統、骨グロシ目とシルリフォーム、並行してエレクトロレセプションを進化させ、テレオスト(ジムノチフォルム、モルミリド、および系統アストロズコプス、マラプテルス、シノドンティス)の5つの系統並行して進化した電気発生。共通の遺伝的アーキテクチャ^を共有するこれらの独立した派生表現型には、顕著な程度の^{収束があります。}

これはおそらく、弱い電界を生成し、検出し、弱い電気魚と呼ばれるジムノチフォームとモルミリド、2種豊富なテレオストクレードの数多くの収束的な特徴によって最もよく例示されています。弱い電気魚が電気を使って周囲を感知し、通信^する4を発見してから50年の間に、科学者のコミュニティは^開発1、5の進化に関する大きな洞察を得ています。 ^,6, システム及び回路 神経科学^7,....

ここに記載されているすべての方法は、ミシガン州立大学の制度動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されています。

1. sgRNAターゲットの選択

注:手順 1.1 で sgRNA を手動で設計するためのプロトコルが用意されています。これはscn4aaターゲット選択に利用された。EFISHGENOMICS Web ポータルを使用してこのプロセス (ステップ 1.2) を容.......

sgRNA標的部位は、セクション1に記載されているように、B.ガウデリオおよびB.ブラキシシウスの両方でscn4aaのエキソン1内で同定された。sgRNAはセクション2の説明に従って生成されました。sgRNAの選択と合成に成功した後(図1)、インビトロ切断を試験した(図2)。その後、インビトロ切断を実証するsgRNAを単一細胞マイクロインジェ?.......

弱い電気魚のフェノチピックな豊かさは、最近のゲノム資源の急増と共に、弱い電気魚モデルにおける機能的ゲノムツールの強い必要性を動機づけている。このシステムは実験室で容易に保たれる魚の並行系統の多数の形質形質の収束の進化のために特に魅力的である。

ここで説明するプロトコルは、電気発生と電気受信を並行して進化させた弱い電気魚の系統におけ?.......

著者らは、モニカ・ルーカス、キャサリン・ショー、ライアン・テイラー、ジャレッド・トンプソン、ニコール・ロビショー、ホープ・ヒーリーの英雄的な努力を認め、魚の夫、データ収集、初期のプロトコル開発に協力してくれた。また、3人の審査員の原稿に対するご提案に感謝申し上げたいと思います。私たちは、彼らのコメントに対処した後、最終的な製品は、より良い品質であると信じています。この研究は、国立科学財団#1644965#1455405からJRGへの支援を受け、自然科学・工学研究協議会のVLSへの助成金を受けています。