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Biology

불꽃을 침묵 : 약한 전기 물고기에서 CRISPR / Cas9 게놈 편집

Published: October 27th, 2019

DOI:

10.3791/60253

1Department of Integrative Biology, Michigan State University, 2Faculty of Life Sciences, Unit of Biology and Ecology of Fishes, Humboldt University, 3Department of Biology, Cape Breton University

여기서, CRISPR/Cas9 게놈 녹아웃 전기 물고기를 생산하고 후방에 프로토콜이 제시된다. 상세히 설명된 것은 체육관 및 모르미리드 모두에 필요한 분자 생물학, 사육 및 축산 요구 사항, 및 Cas9-유도 인델 F0 애벌레를 생산하는 주입 기술이다.

전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 일반적인 유전 아키텍처를 공유하는 이 독립적으로 파생된 표현형에는 수렴의 현저한 정도가 있습니다. 이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades. 약한 전기 물고기가 주변 을 감지하고 의사 소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발, 시스템 및 회로 신경 과학의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다, 세포 생리학, 생태학, 진화 생물학 및 행동. 최근에는 전기 어류에 대한 게놈 자원이 확산되고 있습니다. 이 자원의 사용은 이미 이 종에 있는 유전자형과 표현형 사이 연결에 관하여 중요한 통찰력을 촉진했습니다. 유전체학 데이터를 약한 전기 어류의 자형적 데이터와 통합하는 데 큰 장애물은 기능성 유전체학 도구가 부족하다는 것입니다. 우리는 약한 전기 물고기에 있는 내인성 DNA 복구 기계장치를 이용하는 CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 능력을 발휘하기 위한 가득 차있는 프로토콜을 여기에서 보고합니다. 우리는 이 프로토콜이 CRISPR/Cas9를 사용하여 인델과 포인트 돌연변이를 표적으로 하여 모미리드 종 브리아노미러스 brachyistius와 체육관 브라키하이포무스 고데리오 모두에서 동등하게 효과적이라는 것을 입증합니다. 나트륨 채널 유전자 scn4aa. 이 프로토콜을 사용하여, 두 종으로부터의 배아를 수득하고 유전자형화하여 나트륨 채널 scn4aa의 제1 엑소에서 예측된 돌연변이가 존재했다는 것을 확인하였다. 녹아웃 성공 표현형은 주입되지 않은 크기 일치 대조군과 비교할 때 감소된 전기 기관 방전 진폭을 보여주는 기록으로 확인되었다.

전기 수신 및 전기 발생은 척추 동물의 진화 역사에서 변경되었습니다. 텔레오스트 물고기, 골테오그로시포메 및 실리리폼의 두 계보, 병렬로 진화된 전기 수신, 텔레오스트의 다섯 계보(체육관, 모르미리드, 그리고 제네라 아스트로스코푸스, 말라프테루스, 시노돈티스) 병렬로 진화 전기 발생. 이러한 독립적으로 파생된 표현형에는 공통의 유전 아키텍처1,2,3을공유하는 수렴정도가 눈에 띄는 정도이다.

이것은 아마도 가장 좋은 체육관과 mormyrids의 수많은 수렴 기능에 의해 예시, 생산 하 고 약한 전기 물고기 라고 하는 두 종 풍부한 teleost clades, 약한 전기 물고기 라고. 약한 전기 물고기가 주변을 감지하고의사소통하기 위해 전기를 사용하는 발견 이후 50 년 동안, 과학자의 성장 커뮤니티는 개발1,5의 진화에 엄청난 통찰력을 얻고있다 ,

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여기에 설명된 모든 방법은 미시간 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. sgRNA 표적 선택

참고: 1.1단계에서 sgRNAs의 수동 설계를 위한 프로토콜이 제공됩니다. 이것은 scn4aa 표적 선택에 이용되었다. EFISHGENOMICS 웹 포털을 사용하여 이러한 프로세스(단계 1.2)를 용이하게 하기 위해 추가 프로토콜이 제?.......

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sgRNA 표적 부위는 섹션 1에 기재된 바와 같이 B. gauderio 및 B. brachyistius 둘 다에서 scn4aa의 엑톤 1 내에서 확인되었다. sgRNAs는 섹션 2에 기재된 바와 같이 생성되었다. 성공적인 sgRNA 선택 및합성(도 1)에이어, 시험관내 절단을 시험하였다(도2). 시험관내 절단을 시나는 sgRNAs는 그 후 단일 세포 미세 주사를 위해 선택되었다.

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약한 전기 물고기의 현상학적 풍요로움은 유전체학 자원의 최근 확산과 함께, 약한 전기 물고기 모델에서 기능적 유전체 도구에 대한 강력한 필요성을 동기를 부여합니다. 이 시스템은 실험실에서 쉽게 보관되는 물고기의 병렬 계보에서 수많은 현상형 특성의 수렴 진화로 인해 특히 매력적입니다.

여기에 설명된 프로토콜은 전기 발생과 전기 수신을 병렬로 진화시킨 약한 전.......

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저자들은 모니카 루카스, 캐서린 쇼, 라이언 테일러, 제러드 톰슨, 니콜 로비쇼, 호프 힐리가 물고기 사육, 데이터 수집 및 초기 프로토콜 개발에 도움을 준 영웅적인 노력을 인정한다. 우리는 또한 원고에 대한 그들의 제안에 대한 세 검토자에게 감사드립니다. 우리는 그들의 의견을 해결 한 후 더 나은 품질의 최종 제품을 믿습니다. 이 작품은 국립 과학 재단 #1644965 JRG에 #1455405 지원, 그리고 VLS에 자연 과학 및 공학 연구 위원회 DG 보조금에 의해 지원되었다.

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NameCompanyCatalog NumberComments
20 mg/mL RNA grade GlycogenThermo ScientificR0551
50 bp DNA ladderNEBN3236L
borosilicate glass capillary with filamentSutter InstrumentBF100-58-10(O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length)
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mLPNA BiologyCP01
Dneasy Blood & Tissue KitQiagen69506
Eppendorf FemptoJet 4i MicroinjectorFisher ScientificE5252000021
Eppendorf Microloader Pipette TipsFisher Scientific10289651
Hamilton syringeFisher Scientific14-824-654referred to as "precision glass syringe" in the protocol
KimwipeFisher Scientific06-666referred to as "delicate task wipe" in the protocol
MEGAscript T7 Transcription KitInvitrogenAM1334
NEBuffer 3NEBB7003Sused for in vitro cleavage assay
OneTaq DNA kitNEBM0480L
OvaprimSyndel USAhttps://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.htmlreferred to as "spawning agent" in the protocol
ParafilmFisher ScientificS37440referred to as "thermoplastic" in the protocol
Pipette pullerWPISU-P97sutter brand
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
Reusable needle- requires customizationFisher Scientific7803-02Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25
T4 DNA polymeraseNEBM0203LUse with the 10X NEB buffer that is included
Teflon coated toolsbonefolder.comT-SPATULA4PIECEreferred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol

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