Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.
La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Hay un sorprendente grado de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común. Esto es quizás mejor ejemplificado por las numerosas características convergentes de los gimnoliformes y mormyrids, dos clados de teleost ricos en especies que producen y detectan campos eléctricos débiles y se llaman peces débilmente eléctricos. En los 50 años transcurridos desde el descubrimiento de que los peces débilmente eléctricos utilizan la electricidad para detectar su entorno y comunicarse, una creciente comunidad de científicos ha adquirido enormes perspectivas sobre la evolución del desarrollo, los sistemas y circuitos de neurociencia, fisiología celular, ecología, biología evolutiva y comportamiento. Más recientemente, ha habido una proliferación de recursos genómicos para los peces eléctricos. El uso de estos recursos ya ha facilitado importantes conocimientos con respecto a la conexión entre el genotipo y el fenotipo en estas especies. Un obstáculo importante para integrar los datos genómicos con datos fenotípicos de peces débilmente eléctricos es la falta actual de herramientas genómicas funcionales. Aquí informamos de un protocolo completo para la realización de mutagénesis CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos endógenos de reparación del ADN en peces débilmente eléctricos. Demostramos que este protocolo es igualmente eficaz tanto en la especie mormyrid Brienomyrus brachyistius como en el gymnotiform Brachyhypopomus gauderio mediante el uso de CRISPR/Cas9 para apuntar a indels y mutaciones puntuales en el primer exón de la canal de sodio scn4aa. Utilizando este protocolo, se obtuvieron embriones de ambas especies y se genotiparon para confirmar que las mutaciones pronosticadas en el primer exón del canal de sodio scn4aa estaban presentes. El fenotipo de éxito de knock-out se confirmó con grabaciones que muestran amplitudes de descarga de órganos eléctricos reducidas en comparación con los controles de tamaño no inyectados.
La electrorecepción y la electrogénesis han cambiado en la historia evolutiva de los vertebrados. Dos linajes de peces teleost, osteoglossiformes y siluriformes, electrorecepción evolucionada en paralelo, y cinco linajes de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, y los géneros Astroscopus, Malapterurus y Synodontis) electrogénesis evolucionada en paralelo. Hay un grado sorprendente de convergencia en estos fenotipos derivados de forma independiente, que comparten una arquitectura genética común1,2,3.
Esto es quizás mejor ejem....
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Michigan.
1. Selección de objetivos sgRNA
NOTA: Se proporciona un protocolo para el diseño manual de los sgRNA en el paso 1.1. Esto se utilizó para la selección de objetivos scn4aa. Se proporciona un protocolo adicional para facilitar este proceso (paso 1.2) utilizando el portal web EFISHGENO.......
Los sitios objetivo del sgRNA se identificaron dentro del exón 1 de scn4aa en B. gauderio y B. brachyistius como se describe en la Sección 1. Los sgRNA se generaron como se describe en la Sección 2. Tras la selección y síntesis exitosas del ARNS(Figura 1), se probó el escote in vitro(Figura 2). Los sgRNA que demostraban el corte in vitro fueron seleccionados para microinyecciones de una sola célula.
L.......
La riqueza fenotípica de los peces débilmente eléctricos, junto con una reciente proliferación de recursos genómicos, motiva una fuerte necesidad de herramientas genómicas funcionales en el modelo de peces débilmente eléctricos. Este sistema es particularmente atractivo debido a la evolución convergente de numerosos rasgos fenotípicos en linajes paralelos de peces, que se mantienen fácilmente en el laboratorio.
El protocolo descrito aquí demuestra la eficacia de la técnica CRISPR/.......
Los autores reconocen los heroicos esfuerzos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud y Hope Healey por su ayuda con la cría de peces, la recopilación de datos y el desarrollo temprano del protocolo. También nos gustaría dar las gracias a los tres críticos por sus sugerencias al manuscrito. Creemos que el producto final es de mejor calidad después de abordar sus comentarios. Este trabajo fue financiado por el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias #1644965 y #1455405 a JRG, y la DG del Consejo de Ciencias Naturales e Ingeniería a VLS.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved