Dämpning av gnistan: CRISPR/Cas9 genom redigering i svagt elektrisk fisk

Här presenteras ett protokoll för att producera och bakre CRISPR/Cas9 Genome knockout elektrisk fisk. Beskrivs i detalj är de nödvändiga molekylära biologi, avel och djurhållning krav för både en gymnotiform och en mormyrid, och injektion tekniker för att producera Cas9-inducerad indel F₀ larver.

Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur. Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent dragen i gymnotiforms och mormyrids, två arter-rika benfisk klader som producerar och upptäcka svaga elektriska fält och kallas svagt elektrisk fisk. Under 50 år sedan upptäckten att svagt elektrisk fisk använder el för att känna sin omgivning och kommunicera, en växande gemenskap av forskare har fått enorma insikter i utvecklingen av utveckling, system och kretsar neurovetenskap, cellulär fysiologi, ekologi, evolutionsbiologi och beteende. På senare tid har det skett en spridning av genomiska resurser för elektrisk fisk. Användningen av dessa resurser har redan underlättat viktiga insikter när det gäller sambandet mellan genotyp och fenotyp hos dessa arter. Ett stort hinder för att integrera genomik-data med fenotypiska data av svagt elektrisk fisk är en närvarande brist på funktionella genomik-verktyg. Vi rapporterar här ett fullständigt protokoll för att utföra CRISPR/Cas9 mutagenes som utnyttjar endogena DNA-reparationsmekanismer i svagt elektrisk fisk. Vi visar att detta protokoll är lika effektivt i både den mormyryd arten brienomyrus brachyistius och gymnotiform brachyhypopomus gauderio genom att använda CRISPR/Cas9 för att rikta indels och punktmutationer i den första exon av natrium kanal gen scn4aa. Med detta protokoll erhölls embryon från båda arterna och genotypades för att bekräfta att de förutspådda mutationerna i den första exon av natrium kanalen scn4aa var närvarande. Den knock-out framgång fenotyp bekräftades med inspelningar som visar minskade elektriska organ urladdnings amplituder jämfört med uninjected storlek matchade kontroller.

Electroreception och electrogenesis har förändrats i den evolutionära historien av ryggradsdjur. Två linjer av benfisk fisk, artikel fiskar och Siluriformes, utvecklades elektromottagning parallellt, och fem linjer av fiskar (Gymnotiformes, mormyrids, och släktena astroscopus, Malapterurus och Synodontis) utvecklades elektrogenes parallellt. Det finns en slående grad av konvergens i dessa oberoende härledda fenotyper, som delar en gemensam genetisk arkitektur^1,2,3.

Detta är kanske bäst exemplifieras av de många konvergent....

Alla metoder som beskrivs här har godkänts av den institutionella djuromsorg och användning kommittén (IACUC) av Michigan State University.

1. Val av sgRNA-mål

Anmärkning: Ett protokoll ges för manuell utformning av sgRNAs i steg 1,1. Detta utnyttjades för scn4aa mål urval. Ett ytterligare protokoll ges för att underlätta denna process (steg 1,2) med hjälp av EFISHGENOMICS webbportal. Det rekommenderas att användare väljer proto.......

SgRNA målplatser identifierades inom exon 1 av scn4aa i både b. gauderio och b. brachyistius som beskrivs i avsnitt 1. SgRNAs genererades enligt beskrivningen i avsnitt 2. Efter lyckad sgRNA-markering och-syntes (figur 1) testades in vitro-klyvning (figur 2). SgRNAs som demonstrerar in vitro-skärning valdes sedan ut för encellig mikroinjektioner.

Vuxna fiskar var konditionerade för reproduktion (avsnitt.......

Den fenotypiska rikedomen av svagt elektrisk fisk, tillsammans med en ny spridning av genomik resurser, motiverar ett starkt behov av funktionella genomiska verktyg i svagt elektrisk fisk modell. Detta system är särskilt attraktivt på grund av den konvergent utvecklingen av många fenotypiska drag i parallella linjer av fisk, som lätt hålls i laboratoriet.

Det protokoll som beskrivs här visar effekten av CRISPR/Cas9 teknik i linjer av svagt elektrisk fisk som utvecklats electrogenesis oc.......

Författarna erkänner heroiska insatser av Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, och Hope Healey för hjälp med fisk hållning, datainsamling, och tidiga protokoll utveckling. Vi vill också tacka de tre granskarna för deras förslag till manuskriptet. Vi anser att slutprodukten är av bättre kvalitet efter att ha adressera deras kommentarer. Detta arbete finansierades genom stöd från National Science Foundation #1644965 och #1455405 till JRG, och Naturvetenskaps-och Ingenjörsvetenskaps rådet DG Grant till VLS.