ديناميات القلة من مستقبلات سطح الخلية في الخلايا الحية من قبل المجهر الداخلي الكلي انعكاس الشامل مع عدد وتحليل السطوع

Summary

ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من الأقليات megfp-الموسومة-مستقبلات التي يسببها يجند ملزمه في غشاء البلازما من الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B).

Abstract

علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، فان بعض الطرق قابله للتطبيق للكشف عن احداث التجميع وقياس درجه التجميع. هنا ، ونحن وصف نهج التصوير لتحديد الدولة المعتدلة القلة من mEGFP-الموسومة-مستقبلات المتجانسات في غشاء الخلايا الحية. يعتمد البروتوكول علي المجهر الداخلي للانعكاس الكلي (TIRF) المدمج مع تحليل العدد والسطوع (N & B). N & B هو أسلوب مشابه للتحليل الطيفي للعلاقة الفلورية (FCS) والرسم البياني للعد الفوتون (PCH) ، والتي تستند إلى التحليل الإحصائي للتقلبات في كثافة الفلورية من الفلورية التي تنشر داخل وخارج الاضاءه حجم خلال فتره المراقبة. علي وجه الخصوص ، N & B هو تبسيط PCH للحصول علي معلومات عن متوسط عدد البروتينات في مخاليط القلة. وتوصف شده تذبذب الكثافة بالسطوع الجزيئي للفلوكوفيري ومتوسط عدد الفلوبوهورس داخل حجم الاضاءه. التالي ، لا يعتبر N & B سوي اللحظتين الاولي والثانية من توزيع السعه ، وهما متوسط الكثافة والتباين. هذا هو ، في الوقت نفسه ، وقوه وضعف الأسلوب. لأنه يتم النظر في لحظات فقط ، N & B لا يمكن تحديد الجزء المولي من القلة غير المعروفة في خليط ، ولكنه فقط يقدر متوسط حاله قله العدد من الخليط. ومع ذلك ، فانه يمكن تطبيقها علي سلسله زمنيه صغيره نسبيا (بالمقارنة مع أساليب لحظه أخرى) من الصور من الخلايا الحية علي أساس بكسل بكسل ، وذلك ببساطه عن طريق رصد تقلبات الوقت من كثافة مضان. فانه يقلل من الوقت الفعلي لكل بكسل إلى بضعة ميكروثانية ، مما يسمح الاستحواذ في النطاق الزمني من ثوان إلى مللي ثانيه ، وهو أمر ضروري لحركيه القلة السريعة. وأخيرا ، يمكن استكشاف مناطق الخلايا الكبيرة وكذلك المقصورات شبه الخلوية.

Introduction

ونحن وصف إجمالي انعكاس الداخلية الفلورية-عدد والسطوع (TIRF-N & B) نهج التصوير لتحديد متوسط الدولة القلة من جزيئات مستقبلات في غشاء البلازما من الخلايا الحية ، وتهدف إلى ربط التجمع مستقبلات ديناميات الوظيفة البيولوجية للبروتينات (الشكل 1).

عند الربط خارج الخلية وملزمه ، والمستقبلات بدء محول الاشاره داخل الخلايا اعتمادا علي التشكيل الخاصة بهم ، والقلة ، والمستقبلات المشتركة المحتملة وتكوين الغشاء. علي الرغم من اهميه وانتشار القلة المستقبلة ، المعترف بها كحدث رئيسي في الإشارات الخلوية^1،2،3،4،

Protocol

1. اعداد العينات

1. اليوم الأول البذور هيلا الخلايا في المتوسط الكامل في تركيز من 100000-200000 خليه/مل في الاطباق الزجاجية القاع. البذور 6-8 تكرار الاطباق.
   ملاحظه: في هذا المثال ، يتم تكمله المتوسطة مع 10 ٪ الحرارة الجنين البقري المنشط مصل (الجندي) ، 1 ملليمتر بيروفات الصوديوم ، 100 U/100 مي.......

Discussion

N & B يتطلب العديد من الاحتياطات في اختيار نموذج الخلية واستراتيجية وضع العلامات. ويمكن تطبيقه فقط علي الخلايا الحية التي لا تزال ملتزمه بثبات خلال وقت التقاط الصورة. ويمكن التعامل مع التقلبات الاضافيه الناجمة عن النزوح الجامد للخلية بأكملها مع نهج استعاده الصورة المناسبة³⁸. و?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections