Oligomerization dynamik af celleoverflade receptorer i levende celler ved total intern refleksion Fluorescens mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke analyse

Summary

Vi beskriver en billedbehandlings metode til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede receptor-oligomerer induceret af ligand binding i plasma membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse.

Abstract

På trods af betydningen og allesteds nærhed af receptor oligomerisering, få metoder er gældende for påvisning klyngedannelse begivenheder og måling af graden af klyngedannelse. Her beskriver vi en Imaging tilgang til at bestemme den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af mEGFP-mærkede-receptor homokomplekser i membranen af levende celler. Protokollen er baseret på total intern refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi kombineret med tal og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode, der svarer til fluorescens-korrelations spektroskopi (FCS) og foton-optællings histogram (PCH), som er baseret på den statistiske analyse af svingningerne i fluorescens intensitet af fluorophorer, der spredes ind og ud af en belysning volumen i løbet af observationstiden. Navnlig er N & B en forenkling af PCH for at indhente oplysninger om det gennemsnitlige antal proteiner i oligomeriske blandinger. Amplituder for intensitets udsving er beskrevet af fluoroforet molekyle lysstyrke og det gennemsnitlige antal fluorophorer inden for belysnings volumenet. N & B betragter således kun første og andet øjeblik af amplitude fordelingen, nemlig den gennemsnitlige intensitet og variansen. Dette er på samme tid, styrken og svagheden af metoden. Da der kun tages hensyn til to øjeblikke, kan N & B ikke bestemme den molære fraktion af ukendte oligomerer i en blanding, men den anslår kun den gennemsnitlige oligomeriserings tilstand for blandingen. Ikke desto mindre kan det anvendes til relativt små tidsserier (sammenlignet med andre moment metoder) af billeder af levende celler på en pixel-for-pixel basis, blot ved at overvåge tids udsving i fluorescens intensitet. Det reducerer den effektive time-per-pixel til et par mikrosekund, tillader erhvervelse i tidsinterval af sekunder til millisekunder, hvilket er nødvendigt for hurtig oligomerisering kinetik. Endelig kan store celleområder såvel som sub-cellulære rum udforskes.

Introduction

Vi beskriver en samlet intern refleksion fluorescens-antal og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilgang til bestemmelse af den gennemsnitlige oligomeriske tilstand af receptor molekyler i plasma membranen af levende celler, sigter mod at forbinde receptoren forsamling dynamik til proteinerne biologiske funktion (figur 1).

Ved ekstracellulær ligand binding initierer receptorer det intracellulære signal transduktion afhængigt af deres kropsbygning, oligomerisering, potentielle Co-receptorer og membran sammensætning. På trods af betydningen og allesteds nærende receptor oligomerisering, anerkendt som en vigtig begivenhed i cellul....

Protocol

1. forberedelse af prøver

1. Dag 1. Frø HeLa celler i komplet medium i en koncentration på 100000-200000 celle/mL i glas-bund retter. Seed 6-8 replikater retter.
   Bemærk: I dette eksempel suppleres mediet med 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flere replikater retter er tilberedt.
2. Dag 2-3. Når cellerne er ved sub-confluency, transficere halvdelen af retterne med protein plasmid og anden halvdel med referenc.......

Discussion

N & B kræver flere forsigtighedsregler i valget af celle model og mærknings strategi. Den kan kun anvendes på levende celler, der forbliver stabilt overholdt under billed optagelsestiden. Ekstra udsving på grund af hele cellens stive forskydning kan håndteres med passende billede restaurering tilgange³⁸. Men generelt, når en celle bevæger sig, cellemembranen også deforme, og struktur deformation, producerer store ekstra varians, introducerer alvorlig begrænsning til analyse af membran pro.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections