कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी द्वारा लिविंग सेल में सेल सरफेस रिसेप्टर्स की ओलिगोमेराइजेशन गतिशीलता संख्या और चमक विश्लेषण के साथ संयुक्त

Summary

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में लिगाण्ड बाइंडिंग द्वारा प्रेरित मेडेगएफपी-टैग-रिसेप्टर ओलिगोमर के औसत ओलिगोमेरिक राज्य के निर्धारण के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है।

Abstract

रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापकता के बावजूद, क्लस्टरिंग घटनाओं का पता लगाने और क्लस्टरिंग की डिग्री को मापने के लिए कुछ तरीके लागू होते हैं। यहां, हम जीवित कोशिकाओं की झिल्ली में mEGFP-टैग-रिसेप्टर होमोकॉम्प्लेक्स की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति निर्धारित करने के लिए एक इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं। प्रोटोकॉल कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी पर आधारित है जो संख्या और चमक (एन एंड बी) विश्लेषण के साथ संयुक्त है। एन एंड बी फ्लोरेसेंस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) और फोटॉन काउंटिंग हिस्टोग्राम (पीसीएच) के समान एक विधि है, जो एक रोशनी में और बाहर फ्लोरोफोरस डिस्टरिंग की फ्लोरेसेंस तीव्रता के उतार-चढ़ाव के सांख्यिकीय विश्लेषण पर आधारित है अवलोकन समय के दौरान मात्रा। विशेष रूप से, एन एंड बी ओलिगोमेरिक मिश्रण में प्रोटीन की औसत संख्या के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए पीसीएच का सरलीकरण है। तीव्रता में उतार-चढ़ाव आयाम फ्लोरोफोर की आणविक चमक और रोशनी की मात्रा के भीतर फ्लोरोफोरस की औसत संख्या द्वारा वर्णित हैं। इस प्रकार, एन एंड बी आयाम वितरण के केवल पहले और दूसरे क्षणों को मानता है, अर्थात्, मतलब तीव्रता और विचरण। यह एक ही समय में, शक्ति और विधि की कमजोरी है । क्योंकि केवल दो क्षणों पर विचार किया जाता है, एन एंड बी एक मिश्रण में अज्ञात ओलिगोमर्स के मोलर अंश का निर्धारण नहीं कर सकता है, लेकिन यह केवल मिश्रण की औसत अल्पाधिकारी स्थिति का अनुमान लगाता है। फिर भी, इसे पिक्सेल-बाय-पिक्सेल आधार पर लाइव कोशिकाओं की छवियों की अपेक्षाकृत छोटी समय श्रृंखला (अन्य क्षण विधियों की तुलना में) पर लागू किया जा सकता है, बस फ्लोरेसेंस तीव्रता के समय के उतार-चढ़ाव की निगरानी करके। यह प्रभावी समय-प्रति-पिक्सेल को कुछ माइक्रोसेकंड तक कम कर देता है, जिससे सेकंड से मिलीसेकंड की समय सीमा में अधिग्रहण की अनुमति मिलती है, जो तेजी से ओलिगोमराइजेशन काइनेटिक्स के लिए आवश्यक है। अंत में, बड़े सेल क्षेत्रों के साथ-साथ उप-सेलुलर डिब्बों का पता लगाया जा सकता है।

Introduction

हम जीवित कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में रिसेप्टर अणुओं की औसत ओलिगोमेरिक स्थिति का निर्धारण करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस-नंबर और ब्राइटनेस (टीआईआरएफ-एन एंड बी) इमेजिंग दृष्टिकोण का वर्णन करते हैं, जिसका लक्ष्य रिसेप्टर असेंबली को जोड़ने के उद्देश्य से प्रोटीन के जैविक कार्य के लिए गतिशीलता(चित्रा 1)।

बाह्य शिकंद बाध्यकारी पर, रिसेप्टर्स उनकी संरचना, अल्पाधिकारी, संभावित सह-रिसेप्टर्स और झिल्ली संरचना के आधार पर इंट्रासेलुलर सिग्नल ट्रांसड्यूक्शन शुरू करते हैं। रिसेप्टर ओलिगोमराइजेशन के महत्व और सर्वव्यापी होने के बावजूद, सेलुलर सिग्नलिंग^1,2,

Protocol

1. नमूना तैयारी

1. 1 दिन। ग्लास-बॉटम व्यंजनों में 100,000-200,000 सेल/mL की एकाग्रता पर पूर्ण माध्यम में बीज वाला कोशिकाएं। बीज 6-8 व्यंजन दोहराने।
   नोट: इस उदाहरण में, माध्यम 10% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय स?.......

Discussion

एनएंडबी को सेल मॉडल और लेबलिंग रणनीति के चुनाव में कई सावधानियों की आवश्यकता होती है। इसे केवल जीवित कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है जो छवि कैप्चर समय के दौरान स्थिर रूप से पालन करते रहते हैं। पूरे सेल.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections