Oligomerisering Dynamics av Cell Surface reseptorer i levende celler av total intern refleksjon fluorescens mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke analyse

Summary

Vi beskriver en tenkelig tilnærming for fastsettelse av gjennomsnittlig oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor oligomers indusert av ligand binding i plasma membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse.

Abstract

Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, er det få metoder som gjelder for å oppdage klynge hendelser og måle graden av klynger. Her beskriver vi en tenkelig tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand mEGFP-Tagged-reseptor homocomplexes i membranen av levende celler. Protokollen er basert på total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinert med tall og lysstyrke (N & B) analyse. N & B er en metode som ligner på fluorescens-korrelasjon spektroskopi (FCS) og Foton telling histogram (PCH), som er basert på statistisk analyse av svingningene i fluorescens intensiteten av fluorophores spre inn og ut av en belysning volum under en observasjonstid. Spesielt er N & B en forenkling av PCH for å få informasjon om gjennomsnittlig antall proteiner i oligomer blandinger. Intensiteten svingninger amplituder er beskrevet av den molekylære lysstyrken på fluoroforen og gjennomsnittlig antall fluorophores innenfor belysning volum. Således, N & B vurderer bare første og andre øyeblikk av amplitude fordelingen, nemlig gjennomsnittet intensitet og varians. Dette er, på samme tid, styrken og svakheten av metoden. Fordi bare to momenter blir vurdert, kan N & B ikke bestemme molar brøkdel av ukjent oligomers i en blanding, men det bare anslår den gjennomsnittlige oligomerisering tilstand av blandingen. Likevel, det kan brukes til relativt liten tid serien (sammenlignet med andre øyeblikk metoder) av bilder av levende celler på en piksel-for-piksel basis, bare ved å overvåke tiden svingninger av fluorescens intensitet. Det reduserer effektiv tid per piksel til noen få mikrosekunder, slik at anskaffelse i tidsintervallet av sekunder til millisekunder, noe som er nødvendig for rask oligomerisering Kinetics. Til slutt kan store celleområder samt sub-cellulære rom utforskes.

Introduction

Vi beskriver en total intern refleksjon fluorescens-nummer og lysstyrke (TIRF-N & B) Imaging tilnærming for å bestemme den gjennomsnittlige oligomer tilstand reseptor molekyler ved plasma membranen av levende celler, med sikte på å knytte reseptoren forsamlingen dynamikk til biologisk funksjon av proteiner (figur 1).

Upon ekstracellulære ligand binding, reseptorer initiere intracellulære signal Transduction avhengig av deres konformasjon, oligomerisering, potensielle co-reseptorer og membran sammensetning. Til tross for viktigheten og ubiquity av reseptor oligomerisering, anerkjent som en viktig hendelse i mobilnettet signa....

Protocol

1. prøveforberedelse

1. Dag 1. Seed HeLa celler i komplett medium ved en konsentrasjon på 100000-200000 Cell/mL i glass-Bottom retter. Seed 6-8 gjenskape retter.
   Merk: I dette eksempelet suppleres mediet med 10% varme deaktivert fosterets storfe serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/Streptomycin. Flere gjenskape retter er forberedt.
2. Dag 2-3. Når cellene er på sub-confluency, transfect halvparten av rettene med proteinet plasmider og andre halvdel med referans.......

Discussion

N & B krever flere forholdsregler ved valg av celle modell og merkings strategi. Den kan bare brukes på levende celler som fortsatt stabilt overholdt under bilde opptakstiden. Ekstra svingninger på grunn av hele cellen stiv forskyvning kan håndteres med riktig bilde restaurering tilnærminger³⁸. Men generelt når en celle beveger seg, cellemembranen også deformeres, og struktur deformasjon, produsere store ekstra varians, introduserer alvorlig begrensning til analyse av membran proteiner. I de.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections