Oligomerisering dynamik cellytan receptorer i levande celler av total inre reflektion fluorescens mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka analys

Summary

Vi beskriver en avbildning metod för bestämning av den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptor oligomerer induceras av ligand bindning i plasmamembranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys.

Abstract

Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, är få metoder som gäller för att upptäcka klusterhändelser och mäta graden av klustring. Här beskriver vi en avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av mEGFP-märkta-receptorn homokomplex i membranet av levande celler. Protokollet är baserat på den totala inre reflektions fluorescens (TIRF) mikroskopi kombinerat med antal och ljusstyrka (N & B) analys. N & B är en metod som liknar fluorescens-korrelationsspektroskopi (FCS) och Photon Counting histogram (PCH), som är baserade på den statistiska analysen av fluktuationerna i fluorescensintensiteten hos fluoroforer som sprider sig in och ut ur en belysnings volym under en observationstid. I synnerhet är N & B en förenkling av PCH för att få information om det genomsnittliga antalet proteiner i oligomeriska blandningar. Intensiteten fluktuation amplituder beskrivs av den molekylära ljusstyrkan hos fluorophore och det genomsnittliga antalet fluorofoder inom belysnings volymen. Således anser N & B endast den första och andra ögonblicken av amplitudfördelningen, nämligen den genomsnittliga intensiteten och variansen. Detta är, på samma gång, styrkan och svagheten i metoden. Eftersom endast två moment anses, N & B kan inte bestämma molar fraktion av okända oligomerer i en blandning, men det bara uppskattar den genomsnittliga oligomerisering tillstånd av blandningen. Det kan dock tillämpas på relativt små tidsserier (jämfört med andra moment metoder) av bilder av levande celler på en pixel-för-pixel-basis, helt enkelt genom att övervaka tids variationer av fluorescensintensiteten. Det minskar den effektiva tiden per pixel till några mikrosekunder, vilket gör att förvärv inom tidsintervallet sekunder till millisekunder, vilket är nödvändigt för snabb oligomerisering kinetik. Slutligen kan stora cellområden och subcellulära fack utforskas.

Introduction

Vi beskriver en total intern reflektion fluorescens-antal och ljusstyrka (TIRF-N & B) avbildning metod för att bestämma den genomsnittliga oligomeriska tillstånd av receptor molekyler vid plasmamembranet i levande celler, som syftar till att länka receptorn församlingen dynamiken till proteiners biologiska funktion (figur 1).

Vid extracellulära ligand bindning, receptorer initiera intracellulära signaltransduktion beroende på deras konformation, oligomerisering, potentiella Co-receptorer och membran sammansättning. Trots betydelsen och ubiquity av receptor oligomerization, erkänd som en viktig händelse i cellulära signaleri....

Protocol

1. provberedning

1. Dag 1. Utsäde HeLa celler i komplett medium vid en koncentration av 100000-200000 cell/mL i glas-botten rätter. Utsäde 6-8 replikera rätter.
   Anmärkning: I detta exempel, mediet kompletteras med 10% Värmeinaktiverade fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 100 U/100 μg penicillin/streptomycin. Flera replikaträtter tillagas.
2. Dag 2-3. När celler är på sub-confluency, transfect hälften av rätterna med proteinet plasmid och andra halvan med referen.......

Discussion

N & B kräver flera försiktighetsåtgärder vid valet av cell modell och märknings strategi. Den kan endast tillämpas på levande celler som förblir stabilt under bildfångst tiden. Extra svängningar på grund av hela cellen stel förskjutning kan hanteras med lämpliga bildrestaurering metoder³⁸. Men i allmänhet när en cell rör sig, cellmembranet också deformeras, och struktur deformation, producerar stor extra varians, introducerar allvarlig begränsning till analysen av membranproteine.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Colour Fast TIRF Leica AM TIRF MC inverted microscope, with smi-automatic TIRF alignment. The microscope is equipped with a diode 488 nm laser, a 100x1.46 oil TIRF objective, Ex/Em Bandpass filters at 490/20 and 525/50, temperature/CO2 incubator and Andor DU 8285 VP EMCCD camera. The microscope is operated by Leica LIF software.	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany
Albumin from Bovine Serum 98% minimun	Sigma-Aldrich, St. Louis, MI, USA	A7906-100G
DMEM without Phenol Red with 25 mM HEPES	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	21063029	Used serum free for microscopy
DMEM high-glucose GlutaMAX I	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10566-016	Used for complete medium
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 10x (PBS)	Biowest, Nuaillé, France	X0515-500
Emission splitting system Photometrics DV2	TeledynePhotometrics, Tucson, AZ, USA
Fetal Bovine Serum, qualified, Brazil	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	10270106	10% inactivated supplement for complete medium
Glass bottom 35-mm sterile 1.5 dishes	MatTek, Ashland, MA, USA	P35G-0.170-14-C	uncoated, glass thickness 0.17 microns
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA
Human cervical carcinoma (HeLa), serum-free animal component (AC) cells	Millipore-Sigma ECACC, Darmstadt, Germany	CB_08011102
iXonEM+ 897 EMCCD (back-illuminated) ANDOR camera controlled by ANDOR Solis software	Oxford Instruments, Andor TM Technology, Abingdon-on-Thames, UK		This camera, installed in an additional port of the microscope, is used for acquiring the N&B time series
Matlab Executable N&B routine	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		download at https://www.cnic.es/en/investigacion/2/1187/tecnologia
MatLab v.2018b	The MathWorks, Inc. Natick, MA, USA		download at https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Penicillin:Streptomycin for tissue culture 100x	Biowhittaker Inc. Walkersville, MD, USA	LONZA 17-602E	supplement for medium at Penicillin/Streptomycin 100U/100µg.
pN1-mEGFP-FGFR1 expression vector	Unit of Gynecological Oncology Research, European Institute of Oncology IRCCS, Milan, Italy		Zamai et al., 2019
pN1-N-Gly-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
pN1-N-Gly-mEGFP-mEGFP-GPI expression vector	Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, Madrid, Spain		Hellriegel et al., 2011
Recombinant FGF2	PeproTech EC, Ltd., London, UK		Ligand solution: 20ng/mL of FGF2 in PBS supplemented with 0.01%BSA.
Sodium pyruvate GIBCO	ThermoFisher Scientific	11360070	1mM supplement for medium
TransIt-LT1 Transfection Reagent	MirusBio LLC, Madison, WI, USA	MIR 2300
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	GIBCO Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA	25200056
Type F Immersion liquid 10 mL	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11513 859
UltraPure BSA (50 mg/mL)	ThermoFisher Scientific	AM2618	0.1% supplement for medium without phenol red used for transfections