A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.
לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.
הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.
האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מק....
הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות.
1. הכנת כלי ניתוח
2. הכנת צלחות תרבות בינונית ורקמה
השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי ?.......
אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות לנעמי גאורני לעזרתה במהלך הכנת איור 7. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הפרויקט הוענק DH על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (פרויקט גרנט 1099922), ועל ידי מימון המשלים שהתקבל קרן מכון העין קווינסלנד.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved