Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.

Abstract

לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.

Introduction

הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.

האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מק....

Protocol

הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות.

1. הכנת כלי ניתוח

  1. לחטא שני זוגות של מלקחיים מספר 4 השען על ידי לספוג אותם בפתרון של 70% אתנול עבור 5 דקות או על ידי אוטוקלינג אותם.

2. הכנת צלחות תרבות בינונית ורקמה

  1. הכינו 100 mL של מדיום התרבות המכיל Opti-הזיכרון 1 (1x) + גלוטמקס-1, 5% סרום העובר העוברי ו 100 U/mL עט/דלקת. זה בינוני התרבות הוא מתאים לתרבויות הקרנית....

Representative Results

השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי ?.......

Discussion

אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

תודות לנעמי גאורני לעזרתה במהלך הכנת איור 7. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הפרויקט הוענק DH על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (פרויקט גרנט 1099922), ועל ידי מימון המשלים שהתקבל קרן מכון העין קווינסלנד.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Attachment factorGibcoS006100A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extractGibco13028014A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chlorideMerckC5670Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 mlLabtek650.550.050
Chondroitin sulphateLKT LaboratoriesC2960This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase IIGibco17105-041Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
EthanolLabtekEA043100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serumGE Healthcare Australia Pty LtdSH30084.03This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mmProscitechG401-13Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSSGibco14025-092Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphateMerckA8960Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamberCNC Components Pty. Ltd.Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamberLudowici Sealing SolutionsRSB012Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1Gibco51985-034A reduced serum medium containing glutamine.
DPBSGibco14190-144Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen StrepGibco15140-122A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dishSarstedt82.14473.001Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 wellCorning IncorporatedCostar 3524A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 wellCorning IncorporatedCostar 3516A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE SelectGibco12563-011A 1X enzyme solution for dissociating cells.
VerseneGibco15040-066A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forcepsLabtekBWMF4Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.

References

  1. Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
  2. Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

156

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved