A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

Summary

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

Abstract

העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.

Introduction

מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)1. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטרוגנית גבוהה של תאים ורוצה לנתח פנוטיפים ברמה תא יחיד.

בתחילה, ניתוחים כגון ספירת וקדי בוצעו על ידי עין, אשר מועדף על ידי כמה חוקרים שכן הוא מספק שליטה ויזואלית מלאה על תהליך הספירה. עם זאת, ניתוח ידני של נתונים כאלה ארוך מדי, מוביל לשונות בין משקיפים, ואינו מספק גישה לתכונות מורכבות יותר כך שגישות באמצעות מחשב הופכות לשימוש נרחב וכמעט בלתי נמנע2. שיטות האינפורמטיקה של bioimage מגדילות באופן משמעותי את היעילות של ניתוח נתונים וחופשיות מהמסובייקטיביות הבלתי נמנעים ומהתטיות הפוטנציאליות של ניתוח הספירה הידנית. הביקוש המוגבר בתחום זה ושיפור כוח המחשב הובילו לפיתוח מספר רב של פלטפורמות ניתוח תמונה. חלקם זמינים באופן חופשי ומעניקים גישה לכלים שונים לביצוע ניתוח עם מחשבים אישיים. סיווג של כלי גישה פתוחה הוקמה לאחרונה3 ו מציג אייסי4 כמו תוכנה רבת עוצמה המשלבת שימושיות ופונקציונליות. יתר על כן, הקרח יש את היתרון של תקשורת עם ImageJ.

עבור משתמשים ללא מומחיות ניתוח תמונה, המכשולים העיקריים הם לבחור את הכלי המתאים בהתאם לפרמטרים בעייתיים כראוי המנגינה כי הם לעתים קרובות לא מובנים היטב. יתר על כן, זמני ההתקנה הם לעתים קרובות ארוך. אייסי מציע ממשק ידידותי למשתמש נקודה-and-לחץ בשם "פרוטוקולים" כדי לפתח זרימת עבודה על ידי שילוב כמה התוספים שנמצאו בתוך אוסף ממצה4. עיצוב מודולרי גמיש וממשק נקודת-ולחיצה להפוך את הגדרת ניתוח ריאלי עבור שאינם מתכנתים. כאן אנו מציגים זרימת עבודה בשם מנתח מבנה משנה, שפותחה בממשק של קרח, שתפקידו לנתח אותות פלורסנט בתאים סלולריים ספציפיים למדוד תכונות שונות כמו בהירות, מספר וקדי, גודל וקדי, והפצה מרחבית. זרימת עבודה זו מטפלת במספר בעיות כגון כימות הטרנסלוקציה של האות, ניתוח של תאים מזוהמים המבטא כתב פלורסנט, או ניתוח של וקדי ממבני משנה סלולריים שונים בתאים בודדים. הוא מאפשר את העיבוד הסימולטני של תמונות מרובות, ותוצאות הפלט מיוצאות לגליון עבודה המופרד בטאבים שניתן לפתוח בתוכניות גיליון אלקטרוני נפוצות.

צינור מנתח מבנה משנה מוצג באיור 1. ראשית, כל התמונות הכלולות בתיקיה שצוינה מעובדות מראש כדי לשפר את האות שלהם ליחס הרעש. שלב זה מגדיל את היעילות של השלבים הבאים ומקטין את זמן הריצה. לאחר מכן, אזורי הריבית (ROIs), המתאימים לאזורי התמונה שבהם יש לזהות את אות הפלורסנט, מזוהים ומחולקים. לבסוף, אות הפלורסנט מנותח והתוצאות מיוצאות לגליון עבודה מופרד באמצעות טאבים.

פילוח של אובייקט (זיהוי גבולות) הוא הצעד המאתגר ביותר בניתוח תמונה, והיעילות שלה קובעת את הדיוק של מדידות התא המתקבלות. האובייקטים הראשונים המזוהים בתמונה (המכונים אובייקטים ראשוניים) הם לעתים קרובות גרעינים מדימויים מוכתמים DNA (DAPI או כתמים), אם כי אובייקטים ראשוניים יכולים להיות גם תאים שלמים, חרוזים, ספאקלס, גידולים, או כל חפץ מוכתם. ברוב התמונות, התאים או הגרעינים הביולוגיים נוגעים זה בזה או חופפים הגורמים לאלגוריתמים פשוטים ומהירים להיכשל. עד היום, אין אלגוריתם אוניברסלי יכול לבצע פילוח מושלם של כל האובייקטים, בעיקר בגלל המאפיינים שלהם (גודל, צורה, או מרקם) לווסת את היעילות של פילוח5. כלי הפילוח המופצים בדרך כלל עם תוכנות מיקרוסקופית (כגון תוכנת הדמיה של המכונות המולקולריות על-ידי מכשירים מולקולריים6, או התוכנה המתקדמת בתחום המחקר של ניקון7) מבוססות בדרך כלל על טכניקות סטנדרטיות כגון התאמת מתאם, סף או פעולות מורפולוגיות. למרות היעילות במערכות בסיסיות, שיטות מוגדרות מאוד אלה מציגות במהירות מגבלות כאשר נעשה בהן שימוש בהקשרים מאתגרים ומדויקים יותר. ואכן, פילוח הוא רגיש מאוד לפרמטרים ניסיוניים כגון סוג תא, צפיפות תאים או סמנים, ולעתים קרובות דורש התאמה חוזרת עבור ערכת נתונים גדולה. זרימת העבודה של מנתח מבנה המשנה משלבת אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה ולצורכי המשתמש. זה בעיקר מציע את האלגוריתם מבוסס סימן הפרשת הצבע8 עבור אובייקטים באשכולות מאוד. היעילות של שיטת פילוח זו מסתמכת על הבחירה של סמנים בודדים בכל אובייקט. סמנים אלה נבחרים באופן ידני ברוב הזמן כדי לקבל פרמטרים נכונים עבור פילוח מלא, המהווה זמן רב מאוד כאשר משתמשים מתמודדים עם מספר גבוה של אובייקטים. מנתח מבנה משנה מציע זיהוי אוטומטי של סמנים אלה, מתן תהליך רב מאוד יעיל פילוח. פילוח הוא, ברוב הזמן, את השלב המגביל של ניתוח תמונה והוא יכול לשנות במידה ניכרת את זמן העיבוד בהתאם לרזולוציה של התמונה, מספר האובייקטים לכל תמונה, והרמה של קיבוץ של אובייקטים. קווי צינורות טיפוסיים דורשים מספר שניות עד 5 דקות לכל תמונה במחשב שולחני רגיל. ניתוח של תמונות מורכבות יותר יכול לדרוש מחשב חזק יותר וכמה ידע בסיסי בניתוח תמונה.

הגמישות והפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחשות עם דוגמאות שונות בתוצאות הנציגים. היתרונות של זרימת עבודה זו מוצגים בעיקר באמצעות המחקר של מבני משנה גרעינית תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. מערכת ההפעלה מקבילה חוסר איזון של הומאוסטזיס החמצון לטובת חמצון והוא קשור עם רמות גבוהות של מינים חמצן תגובתי (ROS). מאז רוס לפעול כמו מולקולות איתות, שינויים בריכוז שלהם לוקליזציה subcellular להשפיע באופן חיובי או שלילי מספר עצום של מסלולים ורשתות המסדירים פונקציות פיזיולוגיות, כולל התמרה אותות, מנגנוני תיקון, ביטוי גנים, מוות תאים, והתפשטות9,10. מערכת ההפעלה היא אפוא מעורב ישירות בפתווגיות שונות (נוירוניווניות ומחלות לב וכלי דם, סרטן, סוכרת, וכו '), אלא גם הזדקנות תאית. לכן, פענוח ההשלכות של מערכת ההפעלה על הארגון של התא האנושי ותפקוד מהווה צעד מכריע בהבנת התפקידים של מערכת ההפעלה בתחילת ופיתוח של הפתווגיות האדם. הוא הוקם כי מערכת ההפעלה מווסת ביטוי גנים על ידי שעתוק מודולים דרך מספר גורמים שעתוק (p53, Nrf2, FOXO3A)11, אבל גם על ידי השפעה על הרגולציה של מספר תהליכים שיתוף ושלאחר ההמרה כגון שחבור חלופיים (as) של טרום rnas12,13,14. שחבור אלטרנטיבי של קידוד ראשוני התעתיקים שאינם קידוד הוא מנגנון חיוני המגביר את קיבולת הקידוד של הגנום על ידי הפקת תעתיק. כפי שהוא מבוצע על ידי מורכב מסובך גדול הנקרא מתחת לפני הזמן, המכיל כמעט 300 חלבונים ו 5 U-עשיר גרעיני קטן RNAs (UsnRNAs)15. הרכבה ספצאומין וכמו הם נשלט באופן הדוק בתאים וכמה צעדים של התבגרות מלבין מתרחשים בתוך תאים גרעיניים פחות ממברנה בשם Cajal גופים. מבני המשנה הגרעיניים הללו מאופיינים באופי הדינמי של המבנה שלהם ובקומפוזיציה שלהם, אשר מתנהלים בעיקר על ידי אינטראקציות רב-הדדיות של רכיבי ה-RNA והחלבון שלהם עם האוסף החלבונים. ניתוח של אלפי תאים עם זרימת העבודה של מנתח מבנה משנה מותר לאפיון של השפעות מעולם לא תיאר של מערכת ההפעלה על Cajal גופים. אכן, השיג נתונים מראים כי מערכת ההפעלה משנה את התגרלות של Cajal הגופים, גרימת הפצה משנה של היווצרות החלבון לתוך foci גרעיני קטן. שינוי כזה של מבנה של הגופים Cajal עלול להשפיע על ההבשלה של הספצאוחלק ולהשתתף אפנון כמו מערכת ההפעלה.

Protocol

הערה: הדרכות ידידותיות למשתמש זמינות באתר האינטרנט של אייסי http://icy.bioimageanalysis.org.

1. הורד אייסי ואת פרוטוקול מנתח מבנה משנה

  1. הורד אייסי מהאתר קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/download) ולהוריד את מבנה המשנה פרוטוקול מנתח : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
    הערה: אם אתה משתמש בערכת הפעלה של 64 סיביות, הקפד להשתמש בגירסת 64 הסיביות של Java. גרסה זו מאפשרת להגדיל את הזיכרון המוקצה קרח (העדפות | כללי | זיכרון מרבי).

2. פתיחת הפרוטוקול

  1. פתח אייסי ולחץ על כלים בתפריט רצועת הכלים .
  2. לחץ על הפרוטוקולים כדי לפתוח את ממשק עורך הפרוטוקולים .
  3. לחץ על טען ופתח את מנתח מבנה משנההפרוטוקול. טעינת פרוטוקול יכולה. להימשך מספר שניות ודא שפתיחת הפרוטוקול הושלמה לפני השימוש בו.
    הערה: זרימת העבודה מורכבת מ -13 בלוקים כלליים המוצגים באיור 2a. כל בלוק פועל כצינור המורכב ממספר תיבות ביצוע תת פעילויות ספציפיות.

3. אינטראקציה עם זרימת העבודה על אייסי

הערה: כל בלוק או תיבה ממוספרים ומכיל דירוג מסוים בתוך זרימת העבודה (איור 2b). על-ידי לחיצה על מספר זה, המיקום הקרוב ביותר האפשרי לראשון מוקצה לבלוק/תיבת שנבחרו ואז את המיקום של בלוקים אחרים/תיבות מאורגן מחדש. כבד את הסדר הנכון של הבלוקים בעת הכנת זרימת העבודה. לדוגמה, גלאי ספוט לחסום צריך ROIs מוגדר מראש כך בלוקים פילוח יש להפעיל לפני בלוקים גלאי ספוט. אל תשנה את מיקום התיבות. אין להשתמש ב-"." בשם התמונה.

  1. על-ידי לחיצה על סמל הפינה השמאלית העליונה, התמוטטות, הרחבה, הגדלה, צרה או הסרת הבלוק (איור 2b).
  2. כל צינור של זרימת העבודה מאופיין ברשת של תיבות המחוברות דרך הקלט והפלט שלהם (איור 2b). כדי ליצור חיבור, לחץ על הפלט ותחזק עד שהסמן יגיע לקלט. ניתן להסיר חיבורים על-ידי לחיצה על תג הפלט .

4. מיזוג ערוצי תמונה

  1. השתמש בבלוק מיזוג ערוצים כדי ליצור תמונות ממוזגות. במקרה הצורך, שנה את שם הקבצים כך שרצפים שימוזגו יהיו בעלי הקידומת של אותו שם ואחריו מפריד נפרד. לדוגמה, רצפים של ערוצים בודדים מתמונה A נקראים בשם: ImageA_red, ImageA_blue.
    הערה: עבור המפריד, אל תשתמש בתווים שכבר קיימים בשם התמונה.
  2. באותה תיקיה, צור תיקיה חדשה אחת לכל ערוץ למיזוג. לדוגמה, כדי למזג ערוצים אדומים, ירוקים וכחולים, צור 3 תיקיות ואחסן את הרצפים המתאימים בתיקיות אלה.
  3. השתמש רק בערוצי המיזוגשל הבלוק, הסר את הבלוקים האחרים ושמור את הפרוטוקול כערוצי מיזוג.
    1. גש לתיבות כדי להגדיר פרמטרים. עבור כל ערוץ, למלא את הארגזים מספר ערוץ x (תיבות 1, 5 או 9), מספר ערוץ התיקייה x (תיבות 2, 6 או 10), ערוץ המפריד x (תיבות 3, 7 או 11) ו- מפת colormap nb x (תיבות 4, 8 ו-12) בהתאמה.
      הערה: תיבות אלה מקובצות אופקית לפי ארבעה, כל שורה התואמת לאותו ערוץ. בכל שורה, תצוגה זמינה גם (תיבות 23, 24, או 25) כדי להמחיש באופן ישיר את הרצף של הערוץ המתאים.
      1. בתיבה מספר ערוץ X, לבחור איזה ערוץ לחלץ (בתמונות RGB קלאסית, 0 = אדום, 1 = ירוק, 2 = כחול). המשתמש ניגש במהירות לערוצים השונים של תמונה בתוך חלון המפקח של אייסי, בכרטיסיה רצף . כתוב את ערך הערוץ הקטן ביותר בשורה העליונה ואת הגבוהה ביותר בשורה התחתונה.
      2. בתיבה מספר ערוץ x, כתוב \ שם התיקייה המכילה תמונות של ערוץ X.
      3. בערוץ המפרידשל התיבה X, כתוב את המפריד המשמש עבור שם התמונה (בדוגמה הקודמת: "_red", "_green" ו-"_blue").
      4. בתיבה מיפוי צבעים ערוץ Nb X, ציין עם מספר שבו מודל מיפוי צבעים להשתמש כדי להמחיש את הערוץ המתאים בקרח. מפות הצבעים הזמינות גלויות בכרטיסיית הרצף של חלון המפקח .
      5. בתבנית התיבה של תמונות ממוזגות (תיבת 28), כתוב את ההרחבה כדי לשמור תמונות ממוזגות:. tif,. gif,. jpg,. bmp או. png.
        הערה: כדי למזג 2 ערוצים בלבד, אל תמלא את ארבע התיבות המתאימות לערוץ השלישי.
    2. בפינה השמאלית העליונה של בלוק מיזוג ערוצים , לחץ על הקישור ישירות לימין התיקיה. בתיבת הדו פתיחה שמופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה רצפים של הערוץ הראשון שהוגדר בערוץ תיקיית התיבה מספר 1 (תיבת 2). לאחר מכן, לחץ על פתח.
    3. הפעל את הפרוטוקול על-ידי לחיצה על החץ השחור בפינה השמאלית העליונה של בלוק מיזוג ערוצים (ראה חלק 7 לפרטים נוספים). תמונות ממוזגות נשמרות בתיקיית מיזוג באותה ספריה כמו התיקיות של ערוצים בודדים.

5. פילוח אזורי העניין

הערה: מנתח מבנה משנה משלב אלגוריתמים פשוטים ומתוחכמים יותר כדי להציע חלופות שונות המותאמות למורכבות התמונה וצרכי המשתמש.

  1. בחר את הבלוק המותאם.
    1. אם אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, או שהמשתמש אינו צריך להבדיל בין אובייקטים באשכולות בנפרד, השתמש בבלוק פילוח A: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות.
    2. כאשר אובייקטים אינם נוגעים זה בזה, אך חלק מהם קרובים, השתמש באפשרות הבלוק פילוח B: אובייקטים לא מקובצים באשכולות.
    3. עבור אובייקטים עם רמת אשכול גבוהה וצורה קמורה, השתמש באפשרות הבלוק פילוח C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה.
    4. אם האובייקטים מציגים רמת אשכול גבוהה ובעלי צורות לא סדירות, השתמש בפלח הבלוק D: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות לא סדירות.
    5. השתמש בבלוק פילוח E: באשכולות ציטופלסמה לפלח לגעת cytoplasms בנפרד באמצעות גרעיני מקוטע כמו סמנים. כדי לעבד את החסימה צריך לעכל גרעינים מקוטע.
      הערה: בלוקים המותאמים לתהליך פילוח של אובייקט ראשי באופן עצמאי כך שניתן להשתמש במספר בלוקים באותה הפעלה כדי להשוות את היעילות שלהם למבנה משנה מסוים או לפלח סוגים שונים של מבני משנה. אם רמת האשכולות היא הטרוגנית בתוך אותה קבוצה של תמונות, לאחר מכן לעבד אובייקטים קטנים ומקובצים באשכולות בנפרד בבלוקים המותאמים.
  2. קשר את output0 (קובץ) של הבלוק בחר תיקיה לקלט התיקיה של בלוק הפילוח שנבחר.
  3. הגדר פרמטרים של בלוק הפילוח שנבחר.
    1. פילוח A: אובייקטים שאינם מקובצים באשכולות ופילוח C: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות קמורה
      1. בתיבה אות ערוץ (תיבת 1), הגדר את הערוץ של האובייקטים לפלח.
      2. כאפשרות, במסנן גאוס של התיבה (תיבה 2), הגדל את ערכי ה-X ו-Y סיגמא אם האות בתוך אובייקטים הוא הטרוגנית. המסנן ' גאוס ' מחליק מרקמים כדי להשיג אזורים אחידים יותר ומגביר את המהירות והיעילות של פילוח של גרעינים. ככל שהאובייקטים קטנים יותר, כך ערך הסיגמא נמוך יותר. הימנע מערכי סיגמא גבוהה. הגדר ערכי ברירת מחדל ל-0.
      3. ב -HK-אמצעי (תיבת 3), הגדר את הפרמטר מחלקות אינטנסיביות ואת הגדלים המינימלי והמקסימלי המשוער (בפיקסלים) של אובייקטים להתגלות.
        הערה: עבור מחלקות אינטנסיביות, ערך של 2 מסווג פיקסלים ב-2 מחלקות: רקע וקידמה. הוא מותאם אפוא כאשר הניגוד בין האובייקטים והרקע הוא גבוה. אם לאובייקטי קידמה יש עוצמות שונות או אם הניגודיות עם הרקע נמוכה, הגדילו את מספר המחלקות. הגדרת ברירת המחדל היא 2. גודל האובייקט ניתן להעריך במהירות על-ידי ציור ROI באופן ידני סביב אובייקט הריבית. גודל ההחזר (הפנים בפיקסלים) מופיע ישירות על התמונה בעת הצבעה עם הסמן או שניתן לגשת אליו בחלון הסטטיסטיקה של ROI (לפתוח אותו מסרגל החיפוש). פרמטרים אופטימליים מזהים כל אובייקט בקידמה ב-ROI יחיד. הם יכולים להיות מוגדרים באופן ידני ב אייסי (איתור ומעקב | HK-אמצעים).
      4. בתיבה מתארי פעיל (תיבת 4), מטב את הזיהוי של גבולות האובייקט. תיעוד ממצה עבור תוסף זה זמין באינטרנט: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Active_Contours. ניתן גם להגדיר את הפרמטרים הנכונים ב-אייסי (איתור ומעקב | מתארי פעיל).
      5. במהלך התהליך, תיקיה נוצרת באופן אוטומטי כדי לשמור תמונות של אובייקטים מקוטע. בתיבה טקסט (תיבת 6), שם תיקיה זו (ex: גרעינים מקוטע). כדי להגדיר את הפורמט עבור שמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (Tiff, Gif, Jpeg, BMP, PNG), למלא את תבנית התיבה של תמונות של אובייקטים מקוטע. התיקיה נוצרת בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
      6. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
    2. פילוח ב': אובייקטים המקובצים באשכולות
      1. בצע את אותם שלבים כמו ב 5.3.1 כדי להגדיר את הפרמטרים של הסדרה שידור הערוץ, HK-אמצעים, מתארי פעיל, הרחבה כדי לשמור אובייקטים מקוטע וטקסט (שורות תיבות אינן זהות כמו בשלב 5.3.1).
      2. בתיבה CALL IJ plugin (תיבת 4), הגדר את הפרמטר מתגלגל כדי לשלוט בחיסור הרקע. הגדר פרמטר זה כ-לפחות בגודל האובייקט הגדול ביותר שאינו חלק מהרקע. הפחתת ערך זה מגבירה את הסרת הרקע, אך יכולה גם לגרום לאובדן של אות קידמה.
      3. בתיבה הפחתת היסטוגרמה אדפטיבית (תיבת 6), שיפור הניגודים בין אובייקטי הקידמה לבין הרקע. הגדלת השיפוע נותן יותר רצפים בניגוד.
      4. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
    3. פילוח D: אובייקטים המקובצים באשכולות עם צורות לא סדירות
      הערה: שלוש שיטות שונות של פילוח חלים על כל תמונה: ראשית,HK-פירושו אשכוליחד עם השיטת המתאר הפעילמוחל. לאחר מכן, האלגוריתם פרשת השבעת(שימוש במפת המרחק Euclidian) מוחל על עצמים שאינם מחולקים קודם לכן. לבסוף,אלגוריתם פרשת שתים מבוסס-סמןמשמש. רק HK-אמצעים ומבוססי סמן שיטות פרשת הדרכים צריך התערבות המשתמש. עבור שתי השיטות, ניתן להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (הגירסה האוטומטית המלאה) או לשנות עבור כל תמונה (גירסה למחצה אוטומטית). אם המשתמש אינו מאומן בשיטות פילוח אלה, העיבוד האוטומטי למחצה מומלץ מאוד. במהלך העיבוד של בלוק זה, נדרשת התערבות ידנית. כשמסתיים שיטת פילוח, על המשתמש להסיר באופן ידני אובייקטים לא מקוטעת לפני תחילת שיטת הפילוח הבאה. אובייקטים מקוטעת בהצלחה נשמרים ולא נחשבים בשלבים הבאים. הבלוק הזה צריך להיות מקושר עם הבלוקבאשכולות/הטרוגנית צורות אובייקטים ראשוניים פילוח תיבת הדולפעול כראוי.
      1. הורד את אוסף ה-ImageJ ב- https://github.com/ijpb/MorphoLibJ/releases. הגירסה ה1.4.0 מורורליג'י משמשת בפרוטוקול זה. מקם את הקובץ MorphoLibJ_-1.4.0. jar בתיקיה קרח/ij/תוספים. מידע נוסף אודות התוכן של אוסף זה זמין ב -https://imagej.net/MorphoLibJ.
      2. בצע את אותם שלבים כמו בשלב 5.3.1 כדי להגדיר פרמטרים של שידור בתיבות הערוץ, מסנן גאוס, מתארי פעיל, הרחבה כדי לשמור אובייקטים מקוטע וטקסט. שורות תיבות אינן זהות לאלה שבשלב 5.3.1.
      3. קבעו פרמטרים לקיזוז ההיסטוגרמה של התיבה (ראו step 5.3.2.3).
      4. כדי להפעיל את הפחת רקע, כתוב כן בהחלת הפחתה ברקע? (תיבת 5). . אחרת, תכתוב לא אם התוסף מופעל, הגדר את הפרמטר המתגלגל (ראה step 5.3.2), בתיבה הפחת רקע (תיבת 7).
      5. אוטומציה של HK-אמצעים: כדי להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (עיבוד אוטומטי מלא), הגדר את ה- Nb של מחלקות (תיבת 11), את הגודל המינימלי (תיבת 12) ואת הגודל המירבי (box13) (ראה שלב 5.3.1). יש להגדיר פרמטרים אלה כדי לבחור מקסימום פיקסלים בחזית ולמטב את האינדיבידואליזציה של אובייקטי הקידמה. עבור גירסת העיבוד האוטומטית למחצה, אין צורך בהתערבות.
      6. אוטומציה של שאיבת הסמן: לגרסה האוטומטית לחלוטין, להרחיב את התיבה מיצוי סמנים פנימיים (תיבת 27) ולהגדיר את הערך של הפרמטר "דינמי" בשורה 13 של הסקריפט. עבור גירסת העיבוד האוטומטית למחצה, אין צורך בהתערבות.
        הערה: סמנים מחולצים על-ידי החלת המרה מורחבת-minima בתמונת קלט הנשלטת באמצעות פרמטר "דינאמי". באלגוריתם פרשת הסיביות המבוסס על סמן, ההצפה מסמנים אלה מדומה לביצוע פילוח של אובייקטים. לצורך פילוח מוצלח של אובייקטי קידמה, יש לחלץ סמן אחד לכל אובייקט בקידמה. ההגדרה של הפרמטר "dynamic" להפקת סמנים אופטימלית תלויה בעיקר ברזולוציה של תמונות. לכן, אם אינך מכיר פרמטר זה, השתמש בגירסה האוטומטית למחצה.
      7. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).
      8. בתחילת העיבוד, תיבות דו-שיח HK-אמצעים הפרמטרים מבוססי סמן פרשת הדרכים פתוח ברציפות. כדי להחיל את אותם הפרמטרים עבור כל התמונות (הגירסה האוטומטית לחלוטין), לחץ על כן. אחרת, לחץ על לא. תיבת מידע נפתחת, לבקש "לקבוע ROIs אופטימלית עם ה-HK-משמעותו תוסף ותמונת סגירה". לחץ על אישור ובאופן ידני להחיל את HK-אמצעי Plugin (איתור ומעקב| HK-פירושו) בתמונה, שנפתחת באופן אוטומטי. בחרו באפשרות ' ייצוא ROIs ' בתיבת התוסף ' הכוונה ל-HK '. החל את הפרמטרים הטובים ביותר שיש ל-ROIs המכיל מקסימום פיקסלים בקידמה וכלה במיטוב האינדיבידואליזציה של אובייקטי הקידמה. כאשר נמצא ROIs אופטימלי, לסגור ישירות את התמונה.
      9. בסוף שיטת הפילוח הראשון, תיבת מידע נפתחת ומבקשת "להסיר ROIs לא רצויות ותמונה קרובה". ROIs אלה מקבילים לגבולות של האובייקטים מקוטע. בחר ב'אישור ' והסר את rois של אובייקטים שאינם מקוטע בתמונה, הנפתחים באופן אוטומטי. ניתן להסיר ROI בקלות על-ידי הצבת הסמן על הגבול שלו ושימוש בלחצן "Delete" של המקלדת. סגור את התמונה. חזור על אותו ההליך לאחר השלמת שלב הפילוח השני.
      10. בשלב זה, אם לחצן YES נבחר עבור האוטומציה המלאה של האלגוריתם המבוסס על סמן הפרשת הצבע, הפרמטרים שהוגדרו קודם לכן יוחלו על כל התמונות.
      11. אם הלחצן לא נבחר, ייפתח תיבת מידע ותבקש "לקבוע ולהתאים סמנים פנימיים". לחץ על אישור ובתוך הממשק imagej של אייסי, עבור תוספים | מורורליג'יי | Minima ו מקסימה| מינימום המורחבת &Amp; מקס. בפעולה, בחר ב- Minima מורחבת.
      12. בחרו ' תצוגה מקדימה ' כדי להמחיש מראש בתמונה שנפתחה אוטומטית כתוצאה מהשינוי. הזז את הדינמיקה עד לסימון הסמנים האופטימליים. סמנים הם קבוצות של פיקסלים עם ערך של 255 (לא בהכרח פיקסלים לבנים). פרמטרים אופטימליים מובילים לסמן אחד לכל אובייקט. התמקד באובייקטים שנותרו שלא מחולקים היטב עם שתי השיטות הקודמות של פילוח.
      13. במידת הצורך, שיפור הסמנים על-ידי החלת פעולות מורפולוגיות נוספות כמו "פתיחה" או "סגירה" (תוספים | מורורליג'יי | מסננים מורפולוגיים). בעת קבלת התמונה הסופית של סמנים, להשאיר אותו פתוח ולסגור את כל התמונות האחרות המסתיימים בתמונה במקור משמש כקלט עבור הפעולה מורחבת המורחבת . לחץ על לא אם התיבה imagej מבקשת לשמור שינויים בתמונה.
      14. בתיבה Nb של תמונות עם תיבת מידע (תיבת 14), קבע כמה תמונות עם תיבות מידע אמורות להופיע.
    4. פילוח ה: ציטופלסמה באשכולות
      הערה: בלוק זה משתמש בגרעין מקוטע בעבר כסמנים בודדים כדי ליזום פילוח ציטופלסמה. ודא שגוש הגרעין של פילוח עובד לפני השימוש בו.
      1. בתיבה ציטופלסמה ערוץ (קופסה 1), הגדר את הערוץ של האות cytoplasmic.
      2. בהרחבה התיבה גרעינים מקוטע (תיבת 2), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של גרעיני מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif.
      3. בתיבה טקסט (box3), כתוב את \Tolename של התיקייה המכילה גרעינים מקוטע.
      4. בתבנית תיבת תמונות של cytoplasms מקוטע (תיבת 4), להגדיר את הפורמט לשימוש עבור שמירת אובייקטים מקוטע תמונות (Tiff, Gif, JPEG, BMP, PNG).
      5. במהלך התהליך, תיקיה נוצרת באופן אוטומטי כדי לשמור תמונות של cytoplasms מקוטע. בתיבה טקסט (קופסה 5), שם תיקיה זו (ex: cytoplasms). התיקיה נוצרת בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
      6. בצע את אותם שלבים כמו בשלב 5.3.1 כדי להגדיר פרמטרים של מסנן גאוסיאני ומתארי פעיל (להיזהר, דרגות התיבה אינם זהים לאלה בשלב 5.3.1).
      7. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7).

6. זיהוי וניתוח אותות פלורסנט

  1. בחר את הבלוק המותאם.
    1. ב ניתוח הפלואורסצנטית לחסום A: 1 ערוץ, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בערוץ אחד בתוך סוג אחד של אובייקט מקוטע: זיהוי של האוסף וקדי (ערוץ אדום) בתוך הגרעין.
    2. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח B: 2 ערוצים באותו תא, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בשני ערוצים בתוך סוג אחד של אובייקט מקוטע: זיהוי של האוסף (אדום הערוץ) ו 53bp1 (ערוץ ירוק) וקדי בתוך הגרעין.
    3. ב בלוק הזריחה ניתוח C: 2 ערוצים בשני תאים, לבצע זיהוי וניתוח של וקדי בערוץ אחד או שניים, במיוחד בתוך הגרעינים ואת ציטופלסמה המקביל שלהם: זיהוי של האוסף וקדי (ערוץ אדום) הן בתוך הגרעין ואת הציטופלסמה המקביל שלה או זיהוי של לאסוף וקדי (ערוץ אדום) בתוך הגרעין ו G3BP וקדי (ירוק ערוץ)
    4. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח D: טרנסלוקציה גלובלית, לחשב את אחוז האות מערוץ אחד בשני תאים סלולריים (a ו-b). לדוגמה, בתוך שיטת הטרנספלסמה/גרעין לאחר הייצוא, לייצא אחוזים מחושבים של אותות גרעיניים ו cytoplasmic עבור כל תמונה בגיליון הסופי "תוצאות". הנוסחה המשמשת לחישוב אחוז האות הגרעיני מוצגת להלן. ניתן להשתמש בבלוק זה עבור כל תא תת-תאי משנה:
      figure-protocol-17255
    5. ב לחסום את הזריחה בניתוח E: כדורית תא בודד, לחשב את אחוז האות מערוץ אחד בשני תאים סלולריים עבור כל תא. בלוק זה מותאם במיוחד לגבי הגרעין/הציטופלסמה שיטת ברמה בודדת תא.
      הערה: מכיוון שחסימת הזריחה החוסמת E: טרנסלוקציה תא בודדת מבצעת ניתוח ברמה של תא בודד, פילוח יעיל של הגרעין והציטופלסמה נדרש.
  2. קשר את output0 (קובץ) של הבלוק בחר תיקייה (לחסום 1) לקלט התיקייה (חיצים לבנים בעיגולים שחורים) של הבלוק הנבחר.
  3. הגדר את הפרמטרים של הבלוק הנבחר.
    1. ניתוח פלואורסצנטית A: 1 ערוץ, ניתוח פלואורסצנטית B: 2 ערוצים באותו תא ו ניתוח פלואורסצנטית C: 2 ערוצים בשני תאים
      1. בתיבה תיקיית התמונות ROI, כתוב את שם התיקיה המכילה תמונות של אובייקטים מקוטע שקדמו לו לוכסן אחורי. (לדוגמה: הגרעין המקוכן).
      2. בתבנית תיבת תמונות של אובייקטים מקוטע (תיבת 2), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif.
      3. ? בתיבה הרוג גבולות, כתוב כן כדי להסיר אובייקטי גבול. . אחרת, תכתוב לא ההתקנה של אוסף מורפוליבג של ImageJ נדרש להשתמש בפונקציה זו (ראה שלב 5.3.3).
      4. בתיבה (es) ערוץ כתמים, הגדר את הערוץ שבו יש לזהות את הכתמים. בתמונות RGB קלאסיות, 0 = אדום, 1 = ירוק, ו-2 = כחול.
      5. בתיבות שם של מולקולה שהותאמה לשפות אחרות, כתוב את שם המולקולה המותאמת לנקודות. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר המולקולות.
      6. בתיבה (es) אדוה לחסום גלאי ספוט, הגדר פרמטרים של זיהוי ספוט עבור כל ערוץ. הגדר את קנה המידה (המוזכר בגודל ספוט) ורגישות הזיהוי (רגישות קטנה יותר מקטינה את מספר הנקודות שזוהו, ערך ברירת המחדל הוא 100 והערך המזערי הוא 0). תיעוד ממצה של תוסף זה זמין באינטרנט: http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Spot_Detector. פרמטרים ניתן גם להגדיר באופן ידני ב אייסי (איתור ומעקב | גלאי ספוט).
      7. כאפשרות, ב -מסנן התיבה ROI לפי גודל, לסנן את האובייקטים מקוטע שבו מזוהים כתמים על ידי הגדרת מרווח גודל (בפיקסלים). שלב זה שימושי במיוחד להסרת אובייקטים שמתחת או מקוטע. כדי להעריך באופן ידני את גודל האובייקטים, ראה שלב 5.3.1. פרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים את הסינון של ROIs לפי גודל. הבלוק 2 ערוצים בשני תאים מכיל שתי תיבות: מסנן גרעינים לפי גודל (תיבת 19) ומסנן ציטופלסמה לפי גודל (box 46).
      8. באופן אופציונלי, בתיבה מסנן כתמים לפי גודל, לסנן את הנקודות שזוהו על פי גודלם (בפיקסלים) כדי להסיר פריטים לא רצויים. כדי להעריך באופן ידני את גודל הספוט, לחץ על איתור ומעקב ופתח את תוסף גלאי הספוט . באפשרויות פלט , בחרו ' ייצוא ל-ROI'. היזהר שפרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים סינון של נקודות לפי גודל, ושמקומות מסוננים אינם נלקחים בחשבון עבור הניתוח. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר הערוצים.
      9. באופן אופציונלי, בנקודות הסינוןשל התיבה, החל מסנן נוסף (ניגודיות, הומוגניות, היקף, המעוגלות) בנקודות שזוהו. היזהר שפרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים סינון ספוט וכתמים מסוננים אינם נלקחים בחשבון עבור הניתוח. מספר השדות שיש להזין תלוי במספר הערוצים.
      10. לחלופין, בתיבות הסף של גודל ספוט, הגדר סף עבור האזור (בפיקסלים) של נקודות שנותחו. מספר הנקודות הנספרות מתחת וממעל לסף זה מיוצא בגיליון האלקטרוני של התוצאות הסופיות. מספר התיבות שיש ליידע תלוי במספר הערוצים.
      11. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7). נתונים מיוצאים בגיליון אלקטרוני של תוצאות שנשמר בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.
    2. ניתוח קרינה פלואורסצנטית D: טרנסלוקציה הכללית וניתוח פלואורסצנטית E: כולל טרנסלוקציה תא בודדים:
      1. בתיבות תמונות של תיקיות (תיבות 1 ו-2), כתוב את \Tolname של התיקיה המכילה תמונות של אובייקטים מקוטע. ב בלוק הפלואורסצנטית ניתוח D: טרנסלוקציה גלובלית, שני סוגים של ROI מזוהים כמו ROI a ו-roi b. עבור בלוק הפלואורסצנטית ניתוח E: כולל טרנסלוקציה תא בודדים, תמונות התיקייה גרעינים מקוטע ותמונות תיקיה תיבות cytoplasms מקוטע , לכתוב את השם של התיקייה המכילה גרעינים מקוטע cytoplasms, בהתאמה.
      2. באות ערוץ התיבה (תיבת 3), הזן את ערוץ האות.
      3. בתבנית תיבת תמונות של אובייקטים מקוטע (תיבת 4), לכתוב את הפורמט המשמש לשמירת תמונות של אובייקטים מקוטע (טיף, jpeg, bmp, png). תבנית ברירת המחדל היא tif. האפשרות ' הרוג גבולות ' זמינה גם להסרת אובייקטי גבול (ראה step 6.3.1).
      4. לחלופין, בתיבות מסנן ROI לפי גודל, לסנן את האובייקטים מקוטע על ידי הגדרת מרווח של גודל (בפיקסלים). שלב זה עשוי להיות שימושי להסרת אובייקטים שמתחת או מקוטע. כדי להעריך באופן ידני את גודל האובייקט, ראה שלב 5.3.1. יש שני שדות להזנה, אחד בכל ערוץ. פרמטרי ברירת המחדל אינם כוללים את הסינון ROI לפי גודל.
      5. הפעל את זרימת העבודה (לפרטים, ראה חלק 7). ייצוא נתונים בתוצאות גיליון אלקטרוני שנשמרו בתיקיה המכילה תמונות ממוזגות.

7. הפעל את הפרוטוקול

  1. כדי לעבד בלוק אחד בהפעלה, הסר את החיבור בין הבלוק שנבחר לבין הבלוק בחר תיקיה. הציבו את הרחוב המבוקשבדרגה 1 . בפינה השמאלית העליונה של בלוק המבוקש, לחץ על הקישור ישירות לימין של התיקיה. בתיבת הדו פתיחה שמופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה את התמונות הממוזגות. לאחר מכן, לחץ על פתח. לחץ על הפעלה כדי להפעיל את זרימת העבודה. ניתן לעצור את העיבוד על ידי לחיצה על לחצן עצור .
  2. כדי לעבד בלוקים שונים בריצה, לשמור על החיבורים של בלוקים נבחרים עם בלוק לבחור תיקייה (לחסום 1). ודא שהדירוג שלהם מאפשר עיבוד טוב של זרימת העבודה. לדוגמה, אם בלוק מסוים זקוק לאובייקטים מחולקים לעיבוד, ודא שתהליך החסימה של הפילוח מקודם. לפני הפעלת זרימת העבודה, הסר בלוקים שאינם בשימוש ושמור את הפרוטוקול החדש בשם אחר.
  3. לחץ על הפעלה כדי להפעיל את זרימת העבודה. כאשר תיבת הדו פתוחה מופיעה, לחץ פעמיים על התיקיה המכילה את התמונות הממוזגות. לאחר מכן, לחץ על פתח. זרימת העבודה תופעל באופן אוטומטי. במקרה הצורך, להפסיק את העיבוד על ידי לחיצה על לחצן עצור .
  4. בסוף העיבוד, בדוק שההודעה שבוצעה בוצעה בהצלחה הופיעה בפינה הימנית התחתונה ושכל הבלוקים מסומנים בדגל ירוק (איור 2b). אם לא, הבלוק והתיבה הפנימית המציגים את סימן השגיאה מציינים את האלמנט לתיקון (איור 2b).
    הערה: לאחר שזרימת העבודה בוצעה בהצלחה, לא ניתן להפעיל הפעלה חדשה באופן ישיר ולעבד שוב את זרימת העבודה, לפחות בלוק אחד מסומן בסימן "מוכן לעיבוד". כדי לשנות את מצב הבלוק, מחק וצור מחדש קישור בין שתי תיבות בתוך בלוק זה או פשוט סגור ופתח מחדש את הפרוטוקול. אם מתרחשת שגיאה במהלך העיבוד, ניתן להפעיל הפעלה חדשה ישירות. במהלך הפעלה חדשה, כל גושי הצינור מעובדים, גם אם חלק מהם מסומנים עם השלט הירוק.

תוצאות

כל הניתוחים שתוארו בוצעו על מחשב נייד רגיל (64 סיביות, ארבע ליבות מעבד ב 2.80 GHz עם 16 GB זיכרון גישה אקראית (RAM)) עבודה עם גירסת 64-bit של Java. זיכרון גישה אקראית הוא פרמטר חשוב שיש לשקול, בהתאם לכמות ולרזולוציה של תמונות לצורך ניתוח. באמצעות גירסת 32-bit של Java מגבילה את הזיכרון כ 1300 MB, אשר יכול להיות בלתי מ...

Discussion

מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג'י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פו?...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

G.H. היתה נתמכת על-ידי מלגת מוסמכים מבית המיניצ ' א-לה-שרצ'ה וטכנולוגיות עזר. L.H. היה נתמך על ידי מלגת בוגר מכון דה Cancérologie דה לוריין (כיל), בעוד שקט היה נתמך על ידי מענק ציבורי תנוהלנה על ידי סוכנות המחקר הלאומי הצרפתית (ANR) כחלק השני "הבדיקה של התוכנית" להילחם-HF (התייחסות: ANR-15-RHU4570004). עבודה זו ממומנת על ידי CNRS ואוניברסיטת דה לוריין (UMR 7365).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol freeThermo Fisher Scientific28908to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbitThermo Fisher ScientificA-11008fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouseThermo Fisher ScientificA-21425fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 PhalloidinThermo Fisher ScientificA34055fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)euromedex04-100-812-E
DMEMSigma-AldrichD5796-500mlcell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPISigma-AldrichDUO82040-5MLmounting medium
Human: HeLa S3 cellsIGBMC, Strasbourg, Francecell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)Sigma-AldrichH1009-100mlused as a stressing agent
Lipofectamine 2000 ReagentThermo Fisher Scientific11668-019transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilinabcamab11822Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscopeNikonepifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985062transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)gibco70011-036to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1Thermo Fisher ScientificPA1-1656553BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4Sigma-AldrichSAB4200114EDC4-specific antibody
Triton X-100Roth6683to permeabilize the cells

References

  1. Möckl, L., Lamb, D. C., Bräuchle, C. Super-resolved fluorescence microscopy: Nobel Prize in Chemistry 2014 for Eric Betzig, Stefan Hell, and William E. Moerner. Angewandte Chemie. 53 (51), 13972-13977 (2014).
  2. Meijering, E., Carpenter, A. E., Peng, H., Hamprecht, F. A., Olivo-Marin, J. -. C. Imagining the future of bioimage analysis. Nature Biotechnology. 34 (12), 1250-1255 (2016).
  3. Wiesmann, V., Franz, D., Held, C., Münzenmayer, C., Palmisano, R., Wittenberg, T. Review of free software tools for image analysis of fluorescence cell micrographs. Journal of Microscopy. 257 (1), 39-53 (2015).
  4. de Chaumont, F., et al. Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research. Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).
  5. Girish, V., Vijayalakshmi, A. Affordable image analysis using NIH Image/ImageJ. Indian J Cancer. 41 (1), 47 (2004).
  6. Zaitoun, N. M., Aqel, M. J. Survey on image segmentation techniques. Procedia Computer Science. 65, 797-806 (2015).
  7. . MetaMorph Microscopy Automation and Image Analysis Software Available from: https://www.moleculardevices.com/products/cellular-imaging-systems/acquisition-and-analysis-software/metamorph-microscopy (2018)
  8. . NIS-Elements Imaging Software Available from: https://www.nikon.com/products/microscope-solutions/lineup/img_soft/nis-element (2014)
  9. Meyer, F., Beucher, S. Morphological segmentation. Journal of Visual Communication and Image Representation. 1 (1), 21-46 (1990).
  10. Schieber, M., Chandel, N. S. ROS Function in Redox Signaling and Oxidative Stress. Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).
  11. D'Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (10), 813-824 (2007).
  12. Davalli, P., Mitic, T., Caporali, A., Lauriola, A., D'Arca, D. ROS, Cell Senescence, and Novel Molecular Mechanisms in Aging and Age-Related Diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2016, 3565127 (2016).
  13. Disher, K., Skandalis, A. Evidence of the modulation of mRNA splicing fidelity in humans by oxidative stress and p53. Genome. 50 (10), 946-953 (2007).
  14. Takeo, K., et al. Oxidative stress-induced alternative splicing of transformer 2β (SFRS10) and CD44 pre-mRNAs in gastric epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 297 (2), 330-338 (2009).
  15. Seo, J., et al. Oxidative Stress Triggers Body-Wide Skipping of Multiple Exons of the Spinal Muscular Atrophy Gene. PLOS ONE. 11 (4), 0154390 (2016).
  16. Will, C. L., Luhrmann, R. Spliceosome Structure and Function. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), 003707 (2011).
  17. Ljosa, V., Sokolnicki, K. L., Carpenter, A. E. Annotated high-throughput microscopy image sets for validation. Nature Methods. 9 (7), 637-637 (2012).
  18. Wang, Q., et al. Cajal bodies are linked to genome conformation. Nature Communications. 7, (2016).
  19. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7, 100 (2006).
  20. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biology. 16 (7), 2005970 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Bio161FociJ

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

ISSN 2578-2614

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved

We use cookies to enhance your experience on our website.

By continuing to use our website or clicking “Continue”, you are agreeing to accept our cookies.

Learn More