מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

Summary

אנו מציגים זרימת עבודה זמינה בחופשיות שנבנתה לחיפוש מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתאי תא ספציפיים בתמונות מיקרוסקופית הקרינה. זרימת עבודה ידידותית למשתמש זו מיועדת לתוכנה הפתוחה בקוד הפתוח אייסי ומשתמשת גם בפונקציות ImageJ. הצינור הוא במחיר סביר ללא ידע בניתוח תמונה.

Abstract

העשור האחרון התאפיין בפריצות דרך בטכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטית מומחשות באמצעות שיפור ברזולוציה מרחבית, אלא גם בהדמיית תא חי וטכניקות מיקרוסקופ בתפוקה גבוהה. זה הוביל לעלייה מתמדת בכמות ובמורכבות של נתוני המיקרוסקופיה לניסוי בודד. מכיוון ניתוח ידני של נתונים מיקרוסקופ הוא זמן רב מאוד, סובייקטיבי, ואוסר ניתוחים כמותיים, אוטומציה של ניתוח bioimage הופך כמעט בלתי נמנע. בנינו זרימת עבודה של אינפורמטיקה שנקראת מנתח מבנה משנה כדי להפוך באופן מלא ניתוח אותות לאוטומטי בתמונות bioimages מיקרוסקופ פלורסנט. זרימת עבודה זו מפותחת בפלטפורמת הקוד הפתוח של המשתמש ומסתיימת בפונקציונליות של ImageJ. היא כוללת את העיבוד מראש של תמונות כדי לשפר את האות ליחס הרעש, פילוח בודדים של תאים (זיהוי של גבולות התא) ואת זיהוי/קוונפיקציה של גופי תא מועשר בתאי תאים ספציפיים. היתרון העיקרי של זרימת עבודה זו הוא להציע פונקציונליות ביו-הדמיה מורכבת למשתמשים ללא התמחות בניתוח תמונה באמצעות ממשק ידידותי למשתמש. יתר על כן, הוא מודולרי מאוד ומותאם למספר סוגיות מתוך אפיון טרנסלוקציה גרעינית/cytoplasmic לניתוח השוואתי של גופי תאים שונים במבנים סלולריים שונים. הפונקציונליות של זרימת עבודה זו מומחש דרך המחקר של הגופים Cajal (מפותל) תחת לחץ חמצוני (OS) תנאים. נתונים ממיקרוסקופיה פלואורסצנטית מראים כי היושרה שלהם בתאים אנושיים מושפע כמה שעות לאחר אינדוקציה של מערכת ההפעלה. אפקט זה מאופיין על ידי ירידה של לאסוף את הנוקלאוציה לתוך הגופים Cajal אופייני, הקשורים עם הפצה מחודש של הצמדה של האוסף לתוך מספר גדל של foci קטן. התפקיד המרכזי של הרכב בבורסה בין רכיבי CB לבין הנואופלזמה מרמז כי מערכת ההפעלה הנגרמת מהפצה מראש של האוסף עלולה להשפיע על הקומפוזיציה ועל הפונקציונליות של Cajal הגופים.

Introduction

מיקרוסקופ אור, במיוחד יותר, מיקרוסקופ הקרינה הפלואורסצנטית חזקים ומגוונים בשימוש נפוץ במדעי הביולוגיה. הם נותנים גישה ללוקליזציה מדויקת של biomolecules שונים כמו חלבונים או RNA באמצעות תיוג פלורסנט ספציפי שלהם. העשור האחרון התאפיין בהתקדמות מהירה בטכנולוגיות המיקרוסקופיה והדמיה כפי שמעידים על ידי פרס נובל לכימיה ב-2014 בשנת, הענקת אריק באזיג, סטפן ויליאם א. מוינר לפיתוח מיקרוסקופ הקרינה הסופר-מפוענח (SRFM)¹. SFRM עוקף את המגבלה העקיפה של מיקרוסקופ אופטי מסורתי כדי להביא אותו לתוך הננו-ממד. שיפור בטכניקות כגון הדמיה חיה או גישות לסינון תפוקה גבוהה גם מגביר את הכמות ואת מורכבות הנתונים לטיפול בכל ניסוי. רוב הזמן, החוקרים מתמודדים עם אוכלוסיות הטר....

Protocol

הערה: הדרכות ידידותיות למשתמש זמינות באתר האינטרנט של אייסי http://icy.bioimageanalysis.org.

1. הורד אייסי ואת פרוטוקול מנתח מבנה משנה

1. הורד אייסי מהאתר קרח (http://icy.bioimageanalysis.org/download) ולהוריד את מבנה המשנה פרוטוקול מנתח : http://icy.bioimageanalysis.org/protocols?sort=latest.
   הערה: אם אתה משתמש בערכת הפעלה של 64 סיביות, הקפד להשתמש בגירסת 64 הסיביות של Java. גרסה זו מאפשרת להגדיל את הזיכרון המוקצה קרח (העדפות | כללי | זיכרון מרבי).

2. ....

Discussion

מספר גדל והולך של כלי תוכנה חופשית זמינים לניתוח של תמונות תאים פלואורסצנטית. משתמשים חייבים לבחור בצורה נכונה את התוכנה הנאותה בהתאם למורכבות הבעייתי שלהם, לידע שלהם בעיבוד התמונה, ולזמן שהם רוצים להשקיע בניתוח שלהם. אייסי, CellProfiler, או ImageJ/פיג'י הם כלים רבי-עוצמה המשלבים הן שימושיות והן פו?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde solution (w/v) methanol free	Thermo Fisher Scientific	28908	to fix the cells
Alexa Fluor 488 of goat anti-rabbit	Thermo Fisher Scientific	A-11008	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 of goat anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-21425	fluorescent secondary antibody
Alexa Fluor 555 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A34055	fluorescent secondary antibody
Bovine serum albumin standard (BSA)	euromedex	04-100-812-E
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796-500ml	cell culture medium
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040-5ML	mounting medium
Human: HeLa S3 cells	IGBMC, Strasbourg, France		cell line used to perform the experiments
Hydrogen peroxide solution 30% (H2O2)	Sigma-Aldrich	H1009-100ml	used as a stressing agent
Lipofectamine 2000 Reagent	Thermo Fisher Scientific	11668-019	transfection reagent
Mouse monoclonal anti-coilin	abcam	ab11822	Coilin-specific antibody
Nikon Optiphot-2 fluorescence microscope	Nikon		epifluoresecence microscope
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Thermo Fisher Scientific	31985062	transfection medium
PBS pH 7.4 (10x)	gibco	70011-036	to wash the cells
Rabbit polyclonal anti-53BP1	Thermo Fisher Scientific	PA1-16565	53BP1-specific antibody
Rabbit polyclonal anti-EDC4	Sigma-Aldrich	SAB4200114	EDC4-specific antibody
Triton X-100	Roth	6683	to permeabilize the cells