Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Резюме

Флуоресценция жизни визуализации мониторов, количественно и отличает агрегации тенденции белков в жизни, старение, и подчеркнул C. elegans модели болезни.

Аннотация

Амилоидные фибрилки связаны с рядом нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Гентингтона, Паркинсона или болезнь Альцгеймера. Эти амилоидные фибриллы могут секвестировать эндогенные метастабильные белки, а также компоненты сети протеостаза (PN) и тем самым усугубить неправильное сворачивание белка в клетке. Существует ограниченное количество инструментов для оценки процесса амилоидных белков в животном. Мы представляем протокол для флуоресценции жизни микроскопии (FLIM), что позволяет контролировать, а также количественноать амилоидной фибрилизации в конкретных клетках, таких как нейроны, в неинвазивной образом и с прогрессированием старения и при возмущении PN. FLIM не зависит от уровня экспрессии фторофора и позволяет анализпроцесса агрегации без каких-либо дальнейших окрашивания или отбеливания. Флюорофоры угасают, когда они находятся в непосредственной близости от амилоидных структур, что приводит к снижению срока службы флуоресценции. Закалка напрямую коррелирует с агрегацией амилоидного белка. FLIM является универсальным методом, который может быть применен для сравнения процесса фибрилизации различных амилоидных белков, экологических стимулов, или генетических фонов in vivo в неинвазивной манере.

Введение

Агрегация белка происходит как при старении, так и при заболеваниях. Пути, которые приводят к образованию и осаждению крупных амилоидов или аморфных включений трудно следовать и их кинетика также сложно разгадать. Белки могут неправильно сложиться из-за внутренних мутаций в их последовательности кодирования, как и в случае генетических заболеваний. Белки также неправильно, потому что протеостаз сети (PN), что держит их растворимыми и правильно сложены нарушается, как это происходит во время старения. PN включает в себя молекулярные сопровождающие и машины деградации и отвечает за биогенез, складные, торговые и деградации белков¹.

протокол

1. Синхронизация C. elegans

1. Синхронизируйте C. elegans либо с помощью щелочной гипохлоритной обработки раствора, либо с помощью простого откладывания яйцеклеток в течение 4 ч при 20 градусах По цельсии^8.
2. Выращивайте и поддерживайте нематоды при 20 градусах по Цельсию на пластинах роста нематод (NGM), посеянных с помощью OP50 E. coli в соответствии со стандартными процедурами⁹. Возраст нематод до желаемой стадии развития или день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе, молодые взрослые изображены на 4-й день и старые нематоды изображены на 8-й день жизни.

Результаты

Протокол показывает, как точно контролировать формирование агрегированных видов в живых C. elegans,как во время его естественного старения и при воздействии стресса. Мы отобрали четыре различных штамма трансгенных нематод, выражающих полиглутамин белки либо 40 ", 44" и?.......

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает метод на основе микроскопии для выявления агрегированных видов в модели системы C. elegans. FLIM может точно охарактеризовать наличие как агрегированных, так и растворимых видов, слитых с фторфором, путем измерения их распада флуоресценции. Когд?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Ahringer Library hsp-1 siRNA	Source BioScience UK Limited	F26D10.3
Ampicillin	Carl Roth GmbH + Co. KG	K029.3	Antibiotic
B&H DCS-120 SPC-150	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
B&H SPC830-SPC Image	Becker & Hickl GmbH		FLIM Aquisition software
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
C. elegans iQ44-YFP	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OG412
C. elegans iQ85-YFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans mQ40-RFP			Kind gift from Morimoto Lab
C. elegans nQ40-CFP			Kind gift from Morimoto Lab
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)	Carl Roth GmbH + Co. KG	2316.4
Leica M165 FC	Leica Camera AG		Mounting Stereomicroscope
Leica TCS SP5	Leica Camera AG		Confocal Microscope
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50
PicoQuant PicoHarp300	PicoQuant GmbH		FLIM Aquisition software
Sodium Azide	Carl Roth GmbH + Co. KG	K305.1	Anesthetic
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
Universal Agarose	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500
Zeiss AxioObserver.Z1	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope
Zeiss LSM510-Meta NLO	Carl Zeiss AG		Confocal Microscope