阿西尔-PEGyl交换凝胶移位测定，用于脑膜蛋白棕榈酸化定量测定

Summary

棕榈化需要以可逆的方式将16碳棕榈酰化物与靶蛋白的半胱氨酸残留物结合。在这里，我们描述了一种生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以研究小鼠脑水化剂中任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态。

Abstract

在脑后密度 （PSD） 中突触性 AMPA 受体 （AMPA） 水平的活动相关变化被认为是一种细胞机制的学习和记忆。棕榈化以活动相关的方式调节许多突触蛋白的定位和功能，包括AMPA-R、辅助因子和突触支架。我们确定了突触分化诱导基因（SynDIG）的四个基因系列（SynDIG1-4），编码与AmpARs关联并调节突触强度的特定于大脑的跨膜蛋白。SynDIG1 在位于并列跨膜区域位置 191 和 192 处的两个半胱氨酸残留物处进行棕榈酸酯化，对活动依赖性兴奋突触发育非常重要。在这里，我们描述了一种创新的生化方法，即acyl-PEGyl交换凝胶移位（APEGS）测定，以调查任何感兴趣的蛋白质的棕榈酸化状态，并证明其与小鼠脑水化中蛋白质的SynDIG家族的作用。

Introduction

S-掌上酸化是一种可逆的转化后靶蛋白，调节稳定的膜关联、蛋白质贩运和蛋白质-蛋白质相互作用^1。它涉及通过棕榈酸乙酰乙酰转移酶（PAT）酶催化的硫化物链接，将16碳棕榈酸酶添加到半胱氨酸残留物中。大脑中的许多突触蛋白被棕榈酸化，包括AMPA-R和PSD-95，以活动依赖的方式调节稳定性、定位性和功能^{22，3，4。3,4}通过辅助因素与突触支架（如 PSD-95）之间的相互作用，PSD 中突触性抗量系数水平的变化，导致突触可塑性;因此，确定突触蛋白的棕榈化状态的方法为突触可塑性机制提供了重要的见解。

之前，我们确定了SynDIG家族的四个基因（SynDIG1-4），编码与AmpARs⁵相关的大脑特异性跨膜蛋白。在分离的大鼠河马神经元中，SynDIG1的过度表达或击倒增加或减少，AMPA-R突触的大小和数量与使用免疫细胞化学和电生理学⁵检测到的+50%。我们利用acyl-生物素交换（ABE）测定法来证明SynDIG1在两种保存的共聚体-转膜细胞残留物（存在于所有SynDIG蛋白中）中，以活动相关的方式调节稳定性、定位性和功能

Protocol

所有动物程序都遵循国家卫生研究院 （NIH） 制定的指导方针，并经加州大学戴维斯分校机构动物护理和使用委员会批准。

1. 小鼠脑膜的制备

1. 使用断头器将小鼠斩首，并迅速解剖大脑（如果可能，在+lt;1 分钟内，以尽量减少解剖过程中可能发生的棕榈岛化变化）。在冰上的玻璃均质器（+12冲程）中，在10 mL的均质缓冲液（表1）中立即均质化。
2. 在4°C下，在1，400 x g下，在1，400 x g下，离心机在15分钟内进行浓缩。将上清液转移到冰上的新管。在相同量的均质缓冲液中重新悬浮颗粒（+6 冲程），在710 x g下以离心机在4°C下10分钟。
3. 在4°C下，将来自步骤 1.2 和离心机的超子体以 40，000 x g进行 20 分钟。
4. 丢弃上清液（细胞分数），并在均质化缓冲液中重新悬浮颗粒膜（P2）分数。
   注：样品可以闪光冷冻，储存在-80°C，供以后使用。
5. 执行二头蛋白酸 （BCA） 测定以定量蛋白质水平。对于 APEGS 测定，从 ±100×200 mg 蛋白质（最大 250 毫克）开始，在 1.5 mL 管中，缓冲 A 的体积为 470 μL（表 1）。在 >13，000 x g下进行声波和离心机，在 25°C 下 10 分钟，以....

Discussion

在之前的工作中，我们利用 ABE 测定来证明 SynDIG1 在两种保存的共聚膜细胞残渣（存在于所有 SynDIG 蛋白质中）中以活动相关的方式进行棕榈酸化，以调节稳定性、定位性和功能⁶。一个限制是ABE测定需要亲和纯化与阿甘丝树脂结合作为程序的最后一步，导致信号的重大丢失，使定量分析复杂化。此外，ABE测定无法区分蛋白质是棕榈酸酯一次还是在多个地点。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hydroxylamine (HAM)	ThermoFisher	26103
Methoxy-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)	NOF	ME-050MA	MW ~5000 kDa
Microfuge	Eppendorf	5415R	or equivalent equipment
N-ethylmalemide (NEM)	Calbiochem	34115	Highly toxic.
Optical imager for densitometry	Azure Biosystems	Sapphire Biomolecular Imager	or equivalent equipment
Polypropylene tubes with cap	Fisher Scientific	14-956-1D
Serological pipets (glass)	Fisher Scientific	13-678-27D
Table top centrifuge	Beckman	Allegra X-15R	or equivalent equipment
Tris(2-carboxyethyl) phosphine-hydrochloride (TCEP)	EMD Millipore	580560