Anwendung der Atomkraftmikroskopie zur Erkennung früher Osteoarthritis

Zusammenfassung

Wir präsentieren eine Methode zur Untersuchung früher osteoarthritischer Veränderungen auf zellulärer Ebene im Gelenkknorpel mittels Atomkraftmikroskopie (AFM).

Zusammenfassung

Biomechanische Eigenschaften von Zellen und Geweben regulieren nicht nur ihre Form und Funktion, sondern sind auch entscheidend für die Erhaltung ihrer Vitalität. Veränderungen der Elastizität können sich ausbreiten oder das Auslösen von schweren Krankheiten wie Krebs oder Arthrose (OA) auslösen. Die Atomkraftmikroskopie (AFM) hat sich zu einem starken Werkzeug entwickelt, um die biomechanischen Eigenschaften spezifischer biologischer Zielstrukturen auf mikroskopischer Ebene qualitativ und quantitativ zu charakterisieren und Kräfte in einem Bereich von so klein wie dem Piconewton bis zum Mikronewton zu messen. Biomechanische Eigenschaften sind von besonderer Bedeutung bei Muskel-Skelett-Geweben, die hohen Belastungen ausgesetzt sind. OA als degenerative Erkrankung des Knorpels führt zur Störung der perizellulären Matrix (PCM) und zur räumlichen Neuanordnung der in ihre extrazelluläre Matrix (ECM) eingebetteten Chondrozyten. Störungen in PCM und ECM wurden mit Veränderungen der biomechanischen Eigenschaften des Knorpels in Verbindung gebracht. In der vorliegenden Studie haben wir AFM verwendet, um diese Veränderungen in Bezug auf die spezifischen räumlichen Musteränderungen der Chondrozyten zu quantifizieren. Mit jeder Musteränderung wurden signifikante Veränderungen der Elastizität sowohl für das PCM als auch für das ECM beobachtet. Die Messung der lokalen Elastizität ermöglicht somit direkte Rückschlüsse auf den Grad der lokalen Gewebedegeneration in OA.

Einleitung

Gelenkknorpel ist ein avaskuläres, aneurales Gewebe. Spärlich verstreute Chondrozyten produzieren, organisieren und pflegen eine expansive extrazelluläre Matrix (ECM), in die sie eingebettet sind. Als eigenständiger und spezialisierter Teil des ECM sind Chondrozyten von einer dünnen Schicht spezialisierter Matrix umgeben, die als perizelluläre Matrix (PCM) bekannt ist. Das PCM fungiert als mechanosensitive Zellmatrix-Schnittstelle^1, die die Chondrozyten² schützt und ihre biosynthetische Reaktion moduliert³. Wie bereits beschrieben⁴, sind Chondrozyten in gesunden Knorpeln in....

Protokoll

Die menschlichen Knorpelproben wurden von Patienten entnommen, die sich einer totalen Kniearthroplastik in der Klinik für Orthopädische Chirurgie des Universitätsklinikums Tübingen und dem Winghofer-Krankenhaus Rottenburg a.N. für die Endphase des Knies unterziehen. Vor Beginn der Studie wurde die vollständige Genehmigung des Abteilungs-, institutionellen und lokalen Ethikausschusses eingeholt (Projektnummer 674/2016BO2). Vor der Teilnahme wurde von allen Patienten eine schriftliche Einwilligung in Kenntnis der Sachlage eingesehen. Die Methoden wurden in Übereinstimmung mit den genehmigten Leitlinien durchgeführt.

1. Probenvorbereitung

Ergebnisse

Entlang des physiopathologischen Modells von Saiten zu Doppelsaiten, zu kleinen und schließlich zu großen Clustern, verringerten sich sowohl ECM (Abbildung 3A) als auch PCM (Abbildung 3B) elastische Module zwischen jeder Musteränderung signifikant. Die einzige Ausnahme war der Unterschied im ECM zwischen Zeichenfolgen und Doppelzeichenfolgen (p = 0,072). Die Ergebnisse zeigen, dass sich das ECM/PCM-Verhältnis (Abbildung 4B) nich.......

Diskussion

Mit AFM als neuartige und leistungsstarke Technik zur Messung der biomechanischen Eigenschaften biologischer Materialien auf nanoskaliger Ebene haben wir die elastischen Eigenschaften von ECM und PCM im menschlichen osteoarthritischen Gelenkknorpel gemessen. Knorpelproben wurden nach ihrem vorherrschenden räumlichen Muster der Chondrozytenorganisation als bildbasierter Biomarker für die lokale Gewebedegeneration ausgewählt. Erwartungsgemäß wurde ein starker Rückgang der Elastizitätswerte sowohl von ECM als auch vo.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Merck	A2942
Atomic Force Microscope (AFM)	CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany	JPK00518
AFM head	(CellHesion 200) JPK	JPK00518
Biocompatible sample glue	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	H000033
Cantilever	tip C, k ¼ 7.4 N/m, All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria	AIO-TL-10
Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)	Gibco, Life Technologies, Darmstadt, Germany	41966052
Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM)	AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany	L201306_03
Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine	(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)	F1315
Microspheres	Polysciences	07313-5
Penicillin-Streptomycin	Sigma	P4333
Petri dish heater associated with AFM	JPK Instruments AG, Berlin, Germany	T-05-0117
Scalpel	Feather	2023-01
Tissue culture dishes	TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland	TPP93040
Tissue-tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	SA6255012