ניהול תוך-סחיר של ניסוח אבקה יבשה בעכברים

Summary

ניסוחים אבקה יבשה לשאיפה יש פוטנציאל גדול בטיפול במחלות בדרכי הנשימה. לפני הכניסה למחקרים בבני אדם, יש צורך להעריך את היעילות של ניסוח אבקה יבשה במחקרים פרה-קוליניים. מוצגת שיטה פשוטה ולא פולשנית לניהול אבקה יבשה בעכברים דרך המסלול התוך-מסלולי.

Abstract

בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה שאיפה, חיוני להעריך את הפעילות הביולוגית שלהם במודלים פרה-קוליניים של בעלי חיים. נייר זה מציג שיטה לא פולשנית של אספקה תוך-צדדית של ניסוח אבקה יבשה בעכברים. מוצג התקן טעינת אבקה יבשה המורכב מקצה פיפט לטעינת ג'ל 200 μL המחובר למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת. כמות קטנה של אבקה יבשה (1-2 מ"ג) נטענת לתוך קצה פיפטה ומפוזר על ידי 0.6 מ"ל של אוויר במזרק. בגלל טיפים פיפטה הם חד פעמיים וזולים, ניסוחים אבקה יבשה שונים ניתן לטעון לתוך טיפים שונים מראש. ניסוחים שונים ניתן להעריך באותו ניסוי בעלי חיים ללא ניקוי המכשיר ומילוי מינון, ובכך לחסוך זמן ומבטל את הסיכון של זיהום צולב מאבקה שיורית. ניתן לבדוק את היקף פיזור האבקה על ידי כמות האבקה שנותרה בקצה פיפטה. פרוטוקול של אינטובציה בעכבר עם מקור אור בהתאמה אישית וקנולה מנחה כלול. אינטובציה נכונה היא אחד הגורמים העיקריים המשפיעים על האספקה התוך-סטרית של ניסוח אבקה יבשה לאזור הריאות העמוקות של העכבר.

Introduction

מסלול הריאות של הממשל מציע יתרונות שונים באספקת טיפולים הן לפעולות מקומיות והן לפעולות מערכתיות. לטיפול במחלות ריאה, ריכוז תרופות מקומי גבוה יכול להיות מושגת על ידי משלוח ריאתי, ובכך להפחית את המינון הנדרש ולהוריד את השכיחות של תופעות לוואי מערכתיות. יתר על כן, פעילות אנזימטית נמוכה יחסית בריאה יכולה להפחית את חילוף החומרים של תרופות מוקדמות. הריאות יעילות גם לספיגת תרופות לפעולה מערכתית בשל שטח הפנים הגדול והחדור היטב, שכבת תאי האפיתל הדקה ביותר ונפח הדם הגבוה בנימים ריאתי¹.

פורמולציות אבקה יבשה בשאיפה נחקרו בהרחבה למניעה וטיפול במחלות שונות כגון אסטמה, מחלת ריאות חסימתית כרונית, סוכרת וחיסון ריאתי^2,3,4. תרופות במצב מוצק הם בדרך כלל יציבים יותר מאשר בצורה נוזלית, משאפי אבקה יבשה הם ניידים יותר וידידותי למשתמש מאשר nebulizers^5,6. בהתפתחות של ניסוחים אבקה יבשה בשאיפה, הבטיחות, הפרופיל הפרמקוקינטי ואת היעילות הטיפולית צריך להיות מוערך במודלים פרה-קוליניים בעלי חיים לאחר מתן ריאתי⁷. שלא כמו בני אדם שיכולים לשאוף אבקה יבשה באופן פעיל, משלוח ריאתי של אבקה יבשה לבעלי חיים קטנים הוא מאתגר. יש צורך לקבוע פרוטוקול יעיל של אספקת אבקה יבשה לריאות של בעלי חיים.

עכברים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים של בעלי חיים מחקר כי הם חסכוניים והם מתרבים היטב. הם גם קלים לטיפול ומודלים רבים של מחלות מבוססים היטב. ישנן שתי גישות עיקריות לניהול אבקה יבשה לריאה של העכבר: שאיפה וניהול תוך-כיווני. לשאיפה, העכבר ממוקם בתא גוף שלם או אף בלבד שבו אבקה יבשה הוא אירוסול ובעלי החיים לנשום בתרסיס ללא סם^8,9. ציוד יקר נדרש ויעילות אספקת הסמים נמוכה. בעוד תא כל הגוף עשוי להיות מבחינה טכנית פחות מאתגר, תא החשיפה לאף בלבד יכול למזער את החשיפה של תרופות לפני השטח של הגוף. ללא קשר, עדיין קשה לשלוט במדויק ולקבוע את המינון המועבר לריאות. האבקה היבשה מופקדת בעיקר באזור nasopharynx שבו סיווג רירי בולט¹⁰. יתר על כן, עכברים בתוך התא נמצאים תחת לחץ משמעותי במהלך תהליך הממשל כי הם מוגבלים מקופחים של אספקת מזון ומים¹¹. עבור ניהול תוך-סחיר, זה בדרך כלל מתייחס המבוא של החומר ישירות לתוך קנה הנשימה. ישנן שתי טכניקות שונות כדי להשיג זאת: קנה הנשימה ו אינטובציה orotracheal. הראשון דורש הליך כירורגי שעושה חתך בקנה הנשימה, שהוא פולשני ולעתים רחוקות משמש לניהול אבקה. רק הטכניקה השנייה מתוארת כאן. בהשוואה לשיטת השאיפה, ניהול תוך-סחווי הוא השיטה הנפוצה יותר לאספקה ריאתי בעכבר בגלל יעילות המסירה הגבוהה שלו עם אובדן סמים מינימלי^12,13. זוהי שיטה פשוטה ומהירה כדי לספק בדיוק כמות קטנה של אבקה בתוך כמה מיליגרם לעכבר. למרות שהעכבר נבדל אנטומית ופיזיולוגית לבני אדם וההרדמה נדרשת במהלך תהליך הצנרור, ניהול תוך-סחווי עוקף את דרכי הנשימה העליונות ומציע דרך יעילה יותר להעריך את הפעילות הביולוגית של ניסוח האבקה היבשה כגון ספיגת הריאות, הזמינות הביולוגית והאפקטים הטיפוליים^14,15.

כדי לנהל אבקה יבשה תוך-אופן, העכבר צריך להיות צנרור, אשר יכול להיות מאתגר. בנייר זה מתואר ייצור של אבקה יבשה בהזמנה אישית ומכשיר אינטובציה. ההליכים של אינטובציה ו insufflation של אבקה יבשה בריאה של העכבר הם הפגינו.

Protocol

הניסויים שנערכו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לשימוש בבעלי חיים להוראה ומחקר (CULATR), אוניברסיטת הונג קונג. ניסוחים אבקה יבשה שהוכנו על ידי ייבוש הקפאת ספריי (SFD) המכיל 0.5% של RNA שליח לוציפראז (mRNA), 5% פפטיד סינתטי PEG₁₂KL4 ו 94.5% של מניטול (w / w) משמשים במחקר זה כדי להדגים ביטוי mRNA בריאה¹⁶. הקוטר האווירודינמי החציוני ההמוני (MMAD) של אבקת SFD הוא 2.4 מיקרומטר. אבקת מניטול מיובשת ספריי (SD) משמשים כדי לחקור את ההשפעה של נפח האוויר המשמש פיזור אבקה¹⁶. MMAD של אבקת SD הוא 1.5 מיקרומטר.

1. ייצור של אבקה יבשה אינזלטור והעמסה של אבקה יבשה

1. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' לנטרל את הטעינה הסטטית של אבקה יבשה (בבקבוקון) ואת קצה פיפטה עגול 200 μL ללא מסנן. השתמש באקדח אנטי סטטי או איזון עם פונקציית deionizing על פי הוראות היצרן.
2. מכינים נייר שקילה בגודל של כ 4 ס"מ x 4 ס"מ. מקפלים את הנייר לחצי באלכסון ולאחר מכן לפתוח אותו.
3. שוקלים 1-2 מ"ג אבקה יבשה על נייר השקילה.
4. מלאו טיפ פיפטה לטעינת ג'ל באבקה דרך הפתח הרחב יותר של הקצה. הקש בעדינות כדי לארוז את האבקה עד שהאבקה תסתובב בחופשיות ליד הקצה הצר של הקצה (איור 1A). הימנע אריזת האבקה חזק מדי כפי שהוא עלול לעכב את פיזור אבקה.
5. חברו את הקצה הטעון באבקה למזרק של 1 מ"ל באמצעות עצירה משולשת(איור 1B). ניתן לשנות את גודל המזרק בהתאם לנפח האוויר המשמש לפיזור האבקה. החזק את הקצה ומזרק אנכית במהלך החיבור כדי למנוע שפיכה של אבקה. אם הניהול אינו מבוצע באופן מיידי, השתמש בפרפילם כדי לאטום את פתחי הקצה ולאחסן אותו באופן זמני בתנאים מתאימים עד להנהלה.

2. ייצור של מכשיר אינטובציה

1. מקור אור (איור 2)
   1. הכינו מקור אור בהתאמה אישית עם לפיד דיודה פולט אור (LED) וסיבים אופטיים גמישים בקוטר של 0.8-1 מ"מ.
   2. הפוך פתח ממורכז על העדשה הברורה של לפיד LED עם מקדחה ביד או קצת מקדחה, כך הסיב האופטי בקושי יכול לעבור.
   3. הכנס את הסיב האופטי דרך הפתח. הפעל את לפיד ה- LED כדי לכוונן את המיקום ואת עומק ההכנסה לקבלת בהירות מרבית בקצה השני של הסיב האופטי.
   4. הדבק את הסיב האופטי במיקום עם דבק אפוקסי ברור.
2. קנולה מנחה (איור 3)
   1. קחו פיפט פסטר מפלסטיק 1 מ"ל(איור 3A)והחזיקו את הפיפט בשני קצותיו.
   2. השתמש במנורת אלכוהול (או במקורות חום אחרים במעבדה כגון מבער בונזן) כדי לחמם את אמצע הפיפטה על ידי הצבתה בגובה 5-10 ס"מ מעל הלהבה(איור 3B). סובב את הפיפט כדי לוודא שהוא מחומם באופן שווה.
   3. כאשר הפלסטיק הופך רך ומעוות, להזיז את פיפטה מן הלהבה למתוח את פיפטה בעדינות.
   4. חותכים את הפיפט המתוח באמצע עם זוג מספריים לחלק א' ולחלק ב'(איור 3C-E). השתמשו בחלק א' כטיפ יפה ובחלק ב' כקנולה מנחה. כדי להגדיל את הסיכוי לצנרור מוצלח עם הצינור המנחה, בצע מסגרת משופעת (לא חדה מדי שעלולה להגביר את הסיכון לפגיעה בבעל החיים) בסוף חלק ב'(איור 3F). כאשר קצה פיפטה 200 μL טעינת ג'ל (עבור טעינת אבקה) מוכנס לתוך הצינור המנחה, זה צריך לבלוט את הצינורית על ידי 1-2 מ"מ.
      הערה: קנולה מנחה (חלק B) עם הממד המתאים (קוטר פנימי וחיצוני) עבור אינטובציה יכול להיות 21 מד מחט להתאים בתוכו בזמן שהוא יכול גם להתאים בתוך מחט 17 מד. ייתכן שיהיה צורך בניסיונות מרובים למתוח את הפיפטות כדי להשיג את הממד המתאים.
   5. (אופציונלי): חותכים פתח קטן בקצה הרחב יותר של הצינורית המנחה כדי להפוך אותו לגמיש יותר כך שיהיה קל יותר להחזיק את הסיב האופטי(איור 3F). פתח זה מאפשר גם התאמה של microsprayer לניהול תרסיס נוזלי.

3. אינטובציה

1. הרדמה של העכבר (BALB/c, 7-9 שבועות) עם קטמין (100 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) על ידי הזרקה תוך אישית.
2. הכינו פלטפורמה העשויה פרספקס והרכיבו אותה לדוכן עם מהדק(איור 4A). מניחים את העכבר המרדים על הרציף (בסביבות 60° נטייה) בתנוחה סופית. הגובה והזווית של הנטייה של הפלטפורמה יכול להיות מותאם על ידי המיקום של מהדק על הדוכן.
3. להשעות את העכבר על ידי חיבור החותכות שלו על חוט ניילון (איור 4B). לאבטח את המיקום של העכבר על ידי פיסת קלטת או גומייה.
4. הכנס את הסיב האופטי לתוך הצינורית המנחה לפני הצנרור עם קצה רמת הסיבים עם פתיחת הצינורית המנחה. הפעל את לפיד ה-LED כדי להאיר.
5. בעדינות לבליט את הלשון של העכבר עם זוג מלקחיים כדי לחשוף את קנה הנשימה שלה.
6. השתמש ביד השנייה כדי להחזיק את הצינורית המנחה עם סיבים אופטיים בפנים. הכנס אותם דרך חלל הפה. עם התאורה מהסיבים האופטיים, ניתן לדמיין את פתיחת קנה הנשימה כפתח בין מיתרי הקול.
7. יישרו את מסגרת השופעת של הצינורית המנחה לכיוון קו האמצע של הפתח (איור 5A). צנררו בעדינות את הצינורית המנחה עם סיבים אופטיים לקנה הנשימה על ידי כיוון לקצה הטוב ביותר של הצינורית בפתח קנה הנשימה.
8. לאחר הצנרור, הסירו במהירות את הסיב האופטי והשאירו את הצינורית המנחה בתוך קנה הנשימה (איור 5B). נשימה נורמלית צריכה להיות נצפית.
9. החזק את פיפטה קצה דק (חלק A) בפתיחת הצינור המנחה ואת האינטולט נשיפה קטנה של אוויר (כ 0.2 מ"ל) לתוך הריאה של העכבר. אינפלציה קלה בחזה העכבר מצביעה על אינטובציה נאותה. הסר את פיפטה טיפ דק לפני ניהול אבקה.

4. ניהול אבקה

1. החזק את האבקה טעונה קצה המחובר המזרק כמתואר בשלב 1.5. ודא שזרימת האוויר בין המזרק לקצה מנותקת.
2. משוך את בוכנה מזרק לאחור כדי למשוך 0.6 מ"ל של אוויר.
   הערה: נפח האוויר המשמש לפיזור האבקה תלוי במאפייני האבקה ובכמות האבקה הטעונה. הדבר מתואר עוד יותר בסעיף התוצאות.
3. סובבו את השסתום של העצירה המשולשת כדי לחבר את זרימת האוויר בין המזרק לקצה הטעון באבקה.
4. הכנס את הקצה הטעון באבקה לקנולה המנחה שכבר הונחה בקנה הנשימה של העכבר (איור 5C). החזק את הצינורית המנחה ולדחוף את הבוכנה מזרק בכוח בפעולה רציפה אחת כדי לפזר את האבקה כמו אירוסולים לתוך הריאה.
   הערה: יש למזער כל תנועה קדימה של המכשיר כדי למנוע פגיעה בבעל החיים.
5. הסר את הקצה ובדוק אם האבקה בתוך הקצה התרוקנה. אם לא, חזור על שלב 4.1 עד 4.4.
   הערה: אם האבקה ארוזה חזק מדי עקב הקשה מוגזמת, ייתכן שהיא לא תתפזר כראוי.
6. לאחר השלמת הממשל, הסר את הצינורית המנחה מקנה הנשימה.
7. אפשר לעכבר להתאושש על ידי הצבתו אופקית בתנוחה על-חושית עם לשונו בולטת למחצה כדי למנוע את המצור על דרכי הנשימה.

תוצאות

כאשר אבקה יבשה insufflator משמש כדי לספק תרסיס אבקה לריאה של בעל חיים, נפח האוויר בשימוש הוא קריטי כפי שהוא משפיע על הבטיחות, כמו גם את יעילות פיזור האבקה. כדי לייעל את השיטה, כמויות שונות של אוויר (0.3 מ"ל, 0.6 מ"ל ו 1.0 מ"ל) שימשו כדי לפזר את האבקה היבשה (1 מ"ג של מניטול מיובש ספריי) ומשקל העכברים היה במעק?...

Discussion

בנייר זה, מכשירים בהתאמה אישית עבור זלוף אבקה יבשה אינטובציה תוך-צ'יאלי מוצגים. בשלב טעינת האבקה, אבקה יבשה נטענת לקצה פיפטה 200 μL טעינת ג'ל. חשוב להקיש בעדינות על הקצה כדי לאפשר אריזה רופפת של אבקה בקצה הצר של הקצה. עם זאת, אם האבקה ארוזה חזק מדי, הם ייתקעו בקצה ולא ניתן לפזר כראוי. מומלץ לנטרל ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153