Intratrachealadministration der Trockenpulverformulierung bei Mäusen

Zusammenfassung

Trockenpulverformulierungen zur Inhalation haben ein großes Potenzial bei der Behandlung von Atemwegserkrankungen. Vor dem Eintritt in Studien am Menschen ist es notwendig, die Wirksamkeit der Trockenpulverformulierung in präklinischen Studien zu bewerten. Eine einfache und nichtinvasive Methode zur Verabreichung von Trockenpulver bei Mäusen über den intratrachealen Weg wird vorgestellt.

Zusammenfassung

Bei der Entwicklung von inhalierbaren Trockenpulverformulierungen ist es wichtig, ihre biologischen Aktivitäten in präklinischen Tiermodellen zu bewerten. Dieses Papier führt eine nichtinvasive Methode der intratrachealen Abgabe von Trockenpulverformulierung bei Mäusen ein. Präsentiert wird eine trockene Pulverladevorrichtung, die aus einer 200 l L Gel-Ladepipettenspitze besteht, die über einen Dreiwege-Stopphahn mit einer 1 ml Spritze verbunden ist. Eine kleine Menge Trockenpulver (1-2 mg) wird in die Pipettenspitze geladen und mit 0,6 ml Luft in der Spritze dispergiert. Da Pipettenspitzen Einweg- und Preisprodukte sind, können verschiedene Trockenpulverformulierungen im Voraus in verschiedene Spitzen geladen werden. Verschiedene Formulierungen können im selben Tierexperiment ohne Gerätereinigung und Dosisnachfüllen bewertet werden, wodurch Zeit gespart und das Risiko einer Kreuzkontamination durch Restpulver vermieden wird. Das Ausmaß der Pulverdispersion kann anhand der Inderintauchmenge in der Pipettenspitze untersucht werden. Ein Protokoll der Intubation in der Maus mit einer maßgeschneiderten Lichtquelle und einer Führungskanüle ist enthalten. Die richtige Intubation ist einer der Schlüsselfaktoren, die die intratracheale Abgabe von Trockenpulverformulierung entoltal entherin in den tiefen Lungenbereich der Maus beeinflussen.

Einleitung

Der lungene Verabreichungsweg bietet verschiedene Vorteile bei der Bereitstellung von Therapeutika für lokale und systemische Maßnahmen. Für die Behandlung von Lungenerkrankungen kann eine hohe lokale Medikamentenkonzentration durch Lungenabgabe erreicht werden, wodurch die erforderliche Dosis reduziert und die Inzidenz systemischer Nebenwirkungen verringert wird. Darüber hinaus können die relativ geringen enzymatischen Aktivitäten in der Lunge den vorzeitigen Arzneimittelstoffwechsel reduzieren. Die Lunge ist auch effizient für die Arzneimittelabsorption für systemische Wirkung aufgrund der großen und gut durchfundierten Oberfläche, der extrem dünnen Epithelzellschicht und des hohen Blutvolumens in Lungenkapillaren¹.

Inhalierte Trockenpulverformulierungen wurden umfassend für die Prävention und Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Asthma, chronisch obstruktiver Lungenerkrankung, Diabetes mellitus und Lungenimpfung^2,3,4untersucht. Medikamente im festen Zustand sind in der Regel stabiler als in der flüssigen Form, und trockene Pulverinhalatoren sind tragbarer und benutzerfreundlicher als Vernebler^5,6. Bei der Entwicklung von inhalierten Trockenpulverformulierungen müssen die Sicherheit, das pharmakokinetische Profil und die therapeutische Wirksamkeit in präklinischen Tiermodellen nach lungener^{Verabreichung}7 bewertet werden. Im Gegensatz zu Menschen, die trockenes Pulver aktiv einatmen können, ist die Lungenabgabe von trockenem Pulver an Kleintiere eine Herausforderung. Es ist notwendig, ein effizientes Protokoll für die Lieferung von trockenem Pulver an die Lunge von Tieren zu erstellen.

Mäuse sind weit verbreitet als Forschungstiermodelle verwendet, weil sie wirtschaftlich sind und sie gut brüten. Sie sind auch einfach zu handhaben und viele Krankheitsmodelle sind gut etabliert. Es gibt zwei Hauptansätze, um trockenes Pulver an die Lunge der Maus zu verabreichen: Inhalation und intratracheale Verabreichung. Zum Einatmen wird die Maus in eine Ganzkörper- oder Nasenkammer gelegt, in der trockenes Pulver aerosolisiert wird und die Tiere das Aerosol ohne Sedierung^8,9einatmen. Teure Ausrüstung ist erforderlich und die Wirksamkeit der Medikamentenabgabe ist gering. Während die Ganzkörperkammer technisch weniger anspruchsvoll sein kann, könnte die Nasen-Expositionskammer die Exposition von Medikamenten an der Körperoberfläche minimieren. Unabhängig davon ist es immer noch schwierig, die an die Lunge abgegebene Dosis genau zu kontrollieren und zu bestimmen. Das trockene Pulver wird hauptsächlich in der Nasopharynx-Region abgelagert, wo die Mukociliaary Clearance prominent^{ist 10}. Darüber hinaus sind Mäuse in der Kammer während des Verabreichungsprozesses unter erheblichem Stress, weil sie eingeschränkt und der Nahrungs- und Wasserversorgung beraubt sind¹¹. Für die intratracheale Verabreichung bezieht es sich in der Regel auf die Einführung des Stoffes direkt in die Luftröhre. Es gibt zwei verschiedene Techniken, um dies zu erreichen: Tracheotomie und orotracheale Intubation. Ersteres erfordert einen chirurgischen Eingriff, der einen Schnitt in der Luftröhre macht, die invasiv ist und selten für die Pulververabreichung verwendet wird. Hier wird nur die zweite Technik beschrieben. Im Vergleich zur Inhalationsmethode ist die intratracheale Verabreichung die am häufigsten verwendete Methode zur Lungenabgabe in der Maus wegen ihrer hohen Liefereffizienz bei minimalem Medikamentenverlust^12,13. Es ist eine einfache und schnelle Methode, um eine kleine Menge Pulver innerhalb weniger Milligramm genau an die Maus zu liefern. Obwohl die Maus anatomisch und physiologisch für den Menschen unterscheidet und während des Intubationsprozesses eine Anästhesisierung erforderlich ist, umgeht die intratracheale Verabreichung die oberen Atemwege und bietet eine effektivere Möglichkeit, die biologischen Aktivitäten der Trockenpulverformulierung wie Lungenabsorption, Bioverfügbarkeit und therapeutische Wirkungen^14,15zu bewerten.

Um trockenes Pulver intratracheal zu verabreichen, muss die Maus intubiert werden, was eine Herausforderung sein könnte. In diesem Papier wird die Herstellung eines maßgeschneiderten Trockenpulverinsufflators und einer Intubationsvorrichtung beschrieben. Die Verfahren der Intubation und Insufflation von trockenem Pulver in der Lunge der Maus werden demonstriert.

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Protokoll

Die in dieser Studie durchgeführten Experimente wurden vom Committee on the Use of Live Animals for Teaching and Research (CULATR), der University of Hong Kong, genehmigt. Trockenpulverformulierungen, die durch Sprühgefriertrocknung (SFD) hergestellt werden und 0,5% der Luziferase-Boten-RNA (mRNA), 5% synthetisches Peptid PEG₁₂KL4 und 94,5% Mannitol (w/w) enthalten, werden in dieser Studie verwendet, um die mRNA-Expression in der Lunge zu demonstrieren¹⁶. Der mittlere Aerodynamikdurchmesser (MMAD) des SFD-Pulvers beträgt 2,4 m. Sprühgetrocknetes (SD) Mannitolpulver wird verwendet, um die Wirkung des Luftvolumens in pulverdispersion¹⁶zu untersuchen. Der MMAD aus SD-Pulver ist 1,5 m.

1. Herstellung von Trockenpulver-Insufflator und Beladung von trockenem Pulver

1. (Optional) Neutralisieren Sie die statischen Ladungen von trockenem Pulver (in einer Durchstechflasche) und der 200 L Non-Filter-Rund-Gel-Ladepipettenspitze. Verwenden Sie eine antistatische Pistole oder ein Gleichgewicht mit Deionisierungsfunktion gemäß der Anweisung des Herstellers.
2. Bereiten Sie ein Wägepapier mit einer Größe von ca. 4 cm x 4 cm vor. Falten Sie das Papier in der Hälfte diagonal und dann entfalten.
3. Wiegen Sie 1-2 mg trockenes Pulver auf dem Wägepapier.
4. Füllen Sie eine Gel-Lade-Pipettenspitze mit Pulver durch die breitere Öffnung der Spitze. Tippen Sie vorsichtig, um das Pulver zu verpacken, bis das Pulver lose Agglomerate in der Nähe des schmalen Endes der Spitze bildet (Abbildung 1A). Vermeiden Sie das Verpacken des Pulvers zu eng, da es die Pulverdispersion behindern kann.
5. Schließen Sie die pulverbelastete Spitze über einen Dreiwege-Stoppcock an eine 1 ml Spritze an (Abbildung 1B). Die Größe der Spritze kann entsprechend dem Volumen der Luft geändert werden, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren. Halten Sie die Spitze und Spritze während des Anschlusses vertikal, um das Auslaufen von Pulver zu verhindern. Wenn die Verabreichung nicht sofort durchgeführt wird, verwenden Sie Parafilm, um die Öffnungen der Spitze zu versiegeln und vorübergehend unter geeigneten Bedingungen bis zur Verabreichung aufzubewahren.

2. Herstellung von Intubationsvorrichtung

1. Lichtquelle (Abbildung 2)
   1. Bereiten Sie eine maßgeschneiderte Lichtquelle mit einem Leuchtdiodenbrenner (LED) und einer flexiblen Optischen Faser mit einem Durchmesser von 0,8-1 mm vor.
   2. Machen Sie eine zentrierte Öffnung auf der klaren Linse des LED-Brenners mit einem Handbohrer oder einem Bohrer, so dass die Glasfaser kaum passieren kann.
   3. Legen Sie die Glasfaser durch die Öffnung. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um die Position und die Einfügetiefe für maximale Helligkeit am anderen Ende der Glasfaser einzustellen.
   4. Befestigen Sie die Glasfaser in Position mit klarem Epoxidkleber.
2. Führungskanüle (Abbildung 3)
   1. Nehmen Sie eine 1 ml Kunststoff Pasteur Pipette (Abbildung 3A) und halten Sie die Pipette an beiden Enden.
   2. Verwenden Sie eine Alkohollampe (oder andere Wärmequellen im Labor wie einen Bunsenbrenner), um die Mitte der Pipette zu erhitzen, indem Sie sie bei 5-10 cm über der Flamme platzieren(Abbildung 3B). Drehen Sie die Pipette, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig erhitzt wird.
   3. Wenn der Kunststoff weich und verformbar wird, bewegen Sie die Pipette von der Flamme weg und dehnen Sie die Pipette sanft.
   4. Schneiden Sie die gestreckte Pipette in der Mitte mit einer Schere in Teil A und Teil B (Abbildung 3C-E). Verwenden Sie Teil A als Feinspitzenpipette und Teil B als Führungskanüle. Um die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Intubation mit der Führungskanüle zu erhöhen, machen Sie eine Abschrägung (nicht zu scharf, die das Risiko der Verletzung des Tieres erhöhen kann) am Ende von Teil B (Abbildung 3F). Wenn eine 200 L L Gel-Ladepipettenspitze (für Pulverbelastung) in die Führungskanüle eingesetzt wird, sollte sie um 1-2 mm in die Kanüle ragen.
      HINWEIS: Eine Führungskanüle (Teil B) mit der entsprechenden Dimension (Innen- und Außendurchmesser) für die Intubation könnte eine 21-Spur-Nadel in sie passen, während sie auch in eine 17-Spur-Nadel passen kann. Es können mehrere Versuche erforderlich sein, um die Pipetten zu dehnen, um die entsprechende Dimension zu erreichen.
   5. (Optional): Schneiden Sie eine kleine Öffnung am breiteren Ende der Führungskanüle, um sie flexibler zu machen, so dass es einfacher ist, die Glasfaser zu halten (Abbildung 3F). Diese Öffnung ermöglicht auch den Einbau eines Mikrosprühers für die Verabreichung von flüssigem Aerosol.

3. Intubation

1. Anästhesisieren Sie die Maus (BALB/c, 7-9 Wochen) mit Ketamin (100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion.
2. Bereiten Sie eine Plattform aus Plexiglas vor und montieren Sie sie mit einer Klemme an einen Ständer (Abbildung 4A). Platzieren Sie die anästhesierte Maus auf der Plattform (bei etwa 60° Neigung) in einer Supine-Position. Die Höhe und der Neigungswinkel der Plattform konnten durch die Position der Klemme auf dem Ständer eingestellt werden.
3. Halten Sie die Maus an, indem Sie ihre Schneidezähne an eine Nylonseide hängen (Abbildung 4B). Sichern Sie die Position der Maus durch ein Stück Klebeband oder ein Gummiband.
4. Setzen Sie die optische Faser vor der Intubation mit der Spitze des Faserniveaus mit der Öffnung der Führungskanüle in die Führungskanüle ein. Schalten Sie den LED-Brenner ein, um zu leuchten.
5. Schieben Sie die Zunge der Maus vorsichtig mit einem Paar Zangen hervor, um ihre Luftröhre freizulegen.
6. Verwenden Sie die andere Hand, um die Führungskanüle mit Glasfaser innen zu halten. Legen Sie sie durch die Mundhöhle. Mit der Beleuchtung aus der Optischen Faser kann die Öffnung der Luftröhre als Öffnung zwischen den Stimmbändern visualisiert werden.
7. Richten Sie die Abschrägung der Führungskanüle auf die Mittellinie der Öffnung aus (Abbildung 5A). Intubieren Sie die Führungskanüle mit Glasfaser sanft in die Luftröhre, indem Sie die feinste Spitze der Kanüle auf die Luftröhreeinltenöffnung zielen.
8. Bei der Intubation die optische Faser schnell entfernen und die Führungskanüle in der Luftröhre lassen (Abbildung 5B). Eine normale Atmung sollte beobachtet werden.
9. Halten Sie die feine Spitzenpipette (Teil A) beim Öffnen der Führungskanüle und insuffieren Sie einen kleinen Luftwirbel (ca. 0,2 ml) in die Lunge der Maus. Eine leichte Inflation in der Brust der Maus weist auf eine richtige Intubation hin. Entfernen Sie die Feinspitze Pipette vor der Pulververabreichung.

4. Pulververwaltung

1. Halten Sie die pulverbelastete Spitze, die mit der Spritze verbunden ist, wie in Schritt 1.5 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass der Luftstrom zwischen der Spritze und der Spitze getrennt ist.
2. Ziehen Sie den Spritzenkolben nach hinten, um 0,6 ml Luft zurückzuziehen.
   HINWEIS: Das Volumen der Luft, die verwendet wird, um das Pulver zu dispergieren, hängt von den Eigenschaften des Pulvers und der Menge des geladenen Pulvers ab. Dies wird im Ergebnisabschnitt weiter beschrieben.
3. Drehen Sie das Ventil des Drei-Wege-Stopphahns, um den Luftstrom zwischen der Spritze und der pulverbelasteten Spitze zu verbinden.
4. Setzen Sie die pulverbelastete Spitze in die Führungskanüle ein, die bereits in die Luftröhre der Maus gelegt wurde (Abbildung 5C). Halten Sie die Führungskanüle und drücken Sie den Spritzenkolben in einer kontinuierlichen Aktion, um das Pulver als Aerosole in die Lunge zu zerstreuen.
   HINWEIS: Jede Vorwärtsbewegung des Geräts sollte minimiert werden, um eine Verletzung des Tieres zu vermeiden.
5. Entfernen Sie die Spitze und überprüfen Sie, ob das Pulver in der Spitze geleert wurde. Wenn dies nicht der Fall ist, wiederholen Sie Schritt 4.1 bis 4.4.
   HINWEIS: Wenn das Pulver aufgrund übermäßigen Abklopfens zu fest verpackt ist, wird es möglicherweise nicht richtig dispergiert.
6. Sobald die Verabreichung abgeschlossen ist, entfernen Sie die Führungskanüle aus der Luftröhre.
7. Lassen Sie die Maus sich erholen, indem Sie sie horizontal in einer Supine-Position positionieren, wobei die Zunge halb hervorsteht, um die Blockade der Atemwege zu vermeiden.

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Ergebnisse

Wenn ein Trockenpulver-Insufflator verwendet wird, um Pulveraerosol in die Lunge eines Tieres zu liefern, ist das verwendete Luftvolumen entscheidend, da es sowohl die Sicherheit als auch die Pulverdispersionseffizienz beeinflusst. Zur Optimierung der Methode wurden verschiedene Luftmengen (0,3 ml, 0,6 ml und 1,0 ml) verwendet, um das Trockenepulver (1 mg sprühgetrocknetes Mannitol) zu dispergieren, und das Gewicht von Mäusen wurde 48 Stunden nach der Verabreichung überwacht(Abbildung 6)....

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Diskussion

In diesem Papier werden maßgeschneiderte Geräte zur Trockenpulverinsufflation und intratrachealen Intubation vorgestellt. Im Pulverladeschritt wird Trockenpulver in eine 200-L-Gel-Ladepipettenspitze geladen. Es ist wichtig, vorsichtig auf die Spitze zu tippen, um die lose Verpackung von Pulver am schmalen Ende der Spitze zu ermöglichen. Wenn das Pulver jedoch zu fest verpackt ist, bleiben sie in der Spitze stecken und können nicht richtig dispergiert werden. Es wird empfohlen, die statischen Aufladungen des Pulvers u...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
BALB/c mouse			Female; 7-9 weeks old; Body weight 20-25 g
CleanCap Firefly Luciferase mRNA	TriLink Biotechnology	L-7602
Dry Powder Insufflator	PennCentury	Model DP-4M
Ketamine 10%	Alfasan International B.V.	NA
Light emitting diode (LED) torch	Unilite Internation	PS-K1
Mannitol (Pearlitol 160C)	Roquette	450001
Non-filter round gel loading pipette tip (200 µL)	Labcon	1034-800-000
Nylon floss	Reach	30017050
One milliliter syringe without needle	Terumo	SS-01T
Optical fibre	Fibre Data	OMPF1000
PEG12KL4 peptide	EZ Biolab		(PEG12)-KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK-NH2
Plastic Pasteur fine tip pipette	Alpha Labotatories	LW4061
Three-way stopcock	Braun	D201
Xylazine 2%	Alfasan International B.V.	NA
Zerostat 3 anti-static gun	MILTY	5036694022153