Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
هنا هو المقايسة لتحديد التبدل الجسدي داخل الغلوبولين المناعي الثقيلة سلسلة جراد الجينات باستخدام الخلايا B مركز الجرثومية من بقع باير الماوس.
داخل المراكز الجرثومية للأعضاء اللمفاوية ، تغير الخلايا B الناضجة الغلوبولين المناعي المعبر عنه (Ig) من خلال إدخال طفرات غير مطلية في exons الترميز المتغير للسلسلة الجينية الثقيلة والخفيفة Ig loci. تتطلب عملية التبدل الجسدي هذه (SHM) أنزيم السيتيدين المستحث بالتنشيط deaminase (AID) ، والذي يحول deoxycytidines (C) ، إلى ديوكسيوريدينات (U). معالجة U:G الناتجة عن الإيدز عدم التطابق في الطفرات عن طريق مسارات إصلاح استئصال قاعدة وعدم التطابق يدخل تسلسل الترميز Ig الجديدة التي قد تنتج تقارب أعلى Ig. يمكن أن تمنع الطفرات في جينات إصلاح الإيدز أو الحمض النووي أو تغير بشكل كبير أنواع الطفرات التي لوحظت في Ig loci. نحن نصف بروتوكولا لقياس طفرات JH4 intron التي تستخدم فرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS) وPCR وتسلسل سانجر. على الرغم من أن هذا المقايسة لا تقيس بشكل مباشر نضوج تقارب Ig ، إلا أنها تشير إلى الطفرات في تسلسل الترميز المتغير Ig. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم هذه الطرق تقنيات البيولوجيا الجزيئية الشائعة التي تحلل الطفرات في تسلسل Ig لاستنساخ خلايا B متعددة. وبالتالي، فإن هذا المقايسة هي أداة لا تقدر بثمن في دراسة تنويع SHM وIg.
الخلايا B, أعضاء الجهاز المناعي التكيفي, التعرف على والقضاء على المستضدات عن طريق إنتاج الأجسام المضادة, المعروف أيضا باسم الغلوبولين المناعي (Ig). ويتكون كل Ig من اثنين من الثقيلة (IgH) واثنين من الضوء (IgL) سلسلة polypeptides, التي عقدت معا من قبل السندات ثنائي الكبريتيد لتشكيل بنية الشكل المميز "Y" من Ig1. وN-termini من IgH وIgL تشمل منطقة متغير (V) من كل بوليبتيد ومعا أنها تشكل موقع ملزم مستضد من Ig، في حين أن المنطقة المستمرة من IgH يضفي وظيفة التأثير من Ig. تطوير الخلايا B في نخاع العظام إعادة ترتيب exons الترميز الخامس من IgH وIgL في عملية تعرف باسم V (D)Jإعادةالتركيب 2،3،4. النسخ من exons V المؤتلفة، إلى جانب exons المنطقة الثابتة المعنية، يشكل ميرنا التي تترجم إلى Ig.
الخلايا الناضجة B التي تعبر عن غشاء ملزم Ig ، المعروف أيضا باسم مستقبلات الخلايا B (BCR) ، تدور على الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، مثل الطحال أو العقدة الليمفاوية أو بقع باير ، حيث تقوم بمسح البيئة للمستضدات والتفاعل مع الخلايا الأخرى في الجهاز المناعي1. داخل المراكز الجرثومية (GC) من الأعضاء اللمفاوية الثانوية ، تصبح الخلايا B التي تتعرف على المستضد من خلال BCR نشطة. بمساعدة الخلايا التشعبية الجريبية والخلايا التائية الجريبية المساعد ، يمكن للخلايا B المنشطة أن تتكاثر وتفرق إلى خلايا البلازما والذاكرة ، والتي هي من التأثيرات الهامة للاستجابة المناعية القوية5و6و7و8و9. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تخضع هذه الخلايا B المنشطة لعمليات تنويع الجينات الثانوية Ig - إعادة دمج تبديل الفئة (CSR) والتبدل الجسدي (SHM). أثناء المسؤولية الاجتماعية للشركات، تبادل الخلايا B المنطقة الافتراضية μ ثابت من البوليبتيد IgH مع منطقة ثابتة أخرى (γ، α، ε) من خلال رد فعل حذف الحمض النووي إعادة التركيب(الشكل 1). وهذا يسمح للتعبير عن exon ثابت مختلفة وترجمة Ig جديدة. سوف تتحول الخلية B من التعبير عن IgM إلى نوع متساوي آخر (IgG، IgA، IgE). المسؤولية الاجتماعية للشركات يغير وظيفة التأثير من Ig دون تغيير خصوصية مستضدلها 10،11،12. ومع ذلك ، خلال SHM ، تحور الخلايا B مناطق الترميز V من IgH و IgL لتمكين إنتاج واختيار Igs تقارب أعلى ، والتي يمكن أن تقضي بشكل أكثر فعالية على مستضد13،14،15 ( الشكل1). الأهم من ذلك، كل من المسؤولية الاجتماعية للشركات وSHM تعتمد على وظيفة إنزيم واحد: تنشيط الناجم عن السيتيدين deaminase (الإيدز)16،17،18. البشر والفئران ناقصة في الإيدز لا يمكن إكمال المسؤولية الاجتماعية للشركات أو SHM والحاضر مع ارتفاع الثدي مصل IgM أو Hyper-IgM17,19.
في المسؤولية الاجتماعية للشركات، AID deaminates deoxycytidines (C) في مناطق التبديل المتكررة التي تسبق كل exons الترميز المستمر، وتحويلها إلى deoxyuridines (U)20،21،مما يخلق الاقتران قاعدة غير متطابقة بين deoxyuridines وdoxyguanosines (U:G). يتم تحويل هذه عدم التطابق U:G إلى فواصل الحمض النووي مزدوجة الذين تقطعت بهم السبل، وهي مطلوبة لإعادة دمج الحمض النووي، إما عن طريق إصلاح الختان الأساسي (BER) أو إصلاح عدم التطابق (MMR) المسار22،23،24،25،26،27،28،29. في SHM، المعونة deaminates C داخل exons الترميز الخامس. النسخ المتماثل عبر عدم التطابق U:G يولد C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية, في حين أن إزالة قاعدة uracil من قبل بروتين BER, uracil الحمض النووي جليكوسيلاز (UNG), قبل تكرار الحمض النووي تنتج كل من الانتقال والتحول الطفرات16. طفرات فارغة في UNG زيادة كبيرة C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية21,22. وعلى غرار المسؤولية الاجتماعية للشركات، تتطلب SHM الأدوار التكميلية ل MMR و BER. خلال SHM، يولد MMR الطفرات في أزواج قاعدة A:T. تعطيل الطفرات في MutS homology 2 (MSH2) أو بوليمرات الحمض النووي η (Polη) يقلل بشكل كبير من الطفرات في قواعد A:T والطفرات المركبة في MSH2 وبوله يلغي تقريبا الطفرات في قواعد A:T21,30,31. بما يتفق مع الدور الحاسم ل BER وMMR في تحويل U الناتج عن الإيدز إلى طفرات انتقالية أو متحولة ، تعرض الفئران الناقصة لكل من MSH2 و UNG(MSH2-/-UNG-/-) فقط C:G إلى T:A الطفرات الانتقالية الناتجة عن النسخ المتماثل عبر عدم تطابق U:G21.
تحليل SHM في مناطق الترميز الخامس لا يزال معقدا لأن تطوير الخلايا B يمكن إعادة دمج أي من V (D)J الترميز exons في IgH وIgL loci1،2،4. تحليل دقيق لهذه المناطق V recombined فريدة من نوعها وتحور جسديا يتطلب تحديد وعزل استنساخ الخلايا B أو الجيش الملكي النيبالي Ig11،13. وJH4 intron، الذي هو 3 'من exon الترميز J الماضي في مكان IgH، يؤوي الطفرات الجسدية بسبب انتشار الطفرات 3' من V المروج32،33،34، وبالتالي يستخدم في كثير من الأحيان كعلامة بديلة لSHM في المناطق V31،35 ( الشكل1). لتوضيح تجريبيا كيف جينات محددة أو الطفرات الوراثية تغيير أنماط SHM أو معدلات, يمكن تسلسل intron JH4 من بقع باير (PP) الخلايا B المركز الجرثومي (GCBCs), التي تخضع لمعدلات عالية من SHM36,37,38. يمكن التعرف على GCBCs بسهولة وعزلها مع الأجسام المضادة المقترنة فلوريا ضد علامات سطح الخلية (B220+PNAHI)17،39.
يتم تقديم بروتوكول مفصل لتوصيف الطفرات intron JH4 في PP GCBCs من الفئران باستخدام مزيج من FACS (تفلورسينس تنشيط فرز الخلايا)، PCR، وتسلسل سانجر(الشكل 2).
تم الحفاظ على جميع الفئران المتحولة على خلفية C57BL/6. تم استخدام الفئران الذكور والإناث المطابقة للعمر (2-5 أشهر) لجميع التجارب. تم إجراء تربية الفئران وتجاربها وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها كلية مدينة نيويورك المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.
1. تشريح بقع باير
2. عزل الخلية ل FACS
3. تلطيخ GCBCs ل FACS
4. استخراج الحمض النووي من GCBCs
5. JH4 التضخيم تسلسل intron وتحليل
قياس التدفق الخلوي
الخلايا الناضجة B تعمم على المراكز الجرثومية حيث أنها تخضع لنضوج تقارب، والتوسع اللاستنساخي، والتمايز في خلايا البلازما أو الذاكرة40،41،42،43،44. ويمكن تحديد هذه GCBCs من قبل العديد من علامات سطح الخلية, بما في ذلك التعبير العالي عن مستقبلات CD45R/B220 وملزمة من agglutinin الفول السوداني (PNA)45,46. لعزل GCBCs المنشطة، كانت خلايا PP ملطخة بالأجسام المضادة المضادة B220 المرتبطة بالفيكوريثرين (PE) والبيوتينيلات-PNA، تليها ستريبتافيدين المقترنة APC-eFluor780. تم القضاء على الخلايا الميتة باستخدام الفلورسنت 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) صبغة, الذي يلطخ الحمض النووي من الخلايا المحتضرة أوالميتة 47,48. تم تحليل الخلايا الملطخة في وقت لاحق وفرزها عن طريق قياس التدفق الخلوي. تألفت PPs من ~ 80٪ B220+ خلايا49،50. WT PPs تحتوي على متوسط 4 × 106 خلايا لكل فأرة (الشكل 3A). وكان ما يقرب من 8٪ من خلايا WT PP B220+السلطة الوطنيةالفلسطينية HI، وهو نصف العدد الملاحظ في الإيدز-/ - ( الشكل3B). وهكذا، تم الحصول على 0.3-0.6 ×10 6 B220+PNAHI GCBCs بعد الفرز، والتي كانت كافية لتحليل الطفرات في intron JH4.
تحليل تسلسل JH4
تم تضخيم intron JH4 بواسطة PCR متداخلة باستخدام التمهيديات الأسرة VHJ558 المشتركة (J558FR3Fw وVHJ558.2) تليها JH4 intron تمتد التمهيديات VHJ558.3 وVHJ558.435،37. ومن بين 105 متواليات فريدة تم الحصول عليها من مركبات الكربون الكلورية فلورية WT GCBCs، تم العثور على ما مجموعه 226 طفرة(الشكل 5A). أظهر تحليل طيف طفرة GCBC في فئران WT مجموعة من التحولات والتحولات بمعدل 4 × 10-3 طفرات / bp ، والتي تم حسابها عن طريق قسمة العدد الإجمالي للقواعد المتحولة على العدد الإجمالي للقواعد التي تم تسلسلها32و36و37و38. بالإضافة إلى ذلك، كل JH4 PCR المنتج من WT GCBCs تحتوي على 1-25 الطفرات (الشكل 5B)، حيث تم العثور على طفرات متعددة في كثير من الأحيان على تسلسل واحد33،36. تم تحديد اثنين فقط من الطفرات في 113 AID-/- تسلسل (الشكل 5A). الإيدز-/- أظهرت خلايا B 1.66 × 10-5 طفرات / bp ، والتي كانت أقل بكثير من خلايا WT B (p < 0.05)36 وتقارن بمعدل خطأ البوليميراز عالي الدقة (5.3 × 10-7 sub/base/doubling)51،52. وهكذا، عملت الخلايا AID-/- B كتحكم سلبي مفيد لهذا المقايسة.
الشكل 1: تخطيطي لجراد الجينات IgH والمناطق التي تستهدفها المعونة خلال المسؤولية الاجتماعية للشركات وSHM. يشير الشريط الأحمر إلى intron JH4 580 bp الذي هو 3 ' من إعادة ترتيب VDJH4 ويتم تحليلها في هذا البروتوكول. في المسؤولية الاجتماعية للشركات، تشجع إزالة المخدرات المعتمدة على الإيدز في مناطق التبديل الإلكتروني (Sμ و Sε) على تشكيل DSB الذي يسمح بإعادة التركيب المحذوف والتعبير عن نوع جديد من الأجسام المضادة (IgM to IgE). خلال SHM، تتراكم مناطق V (الصناديق الرمادية) الطفرات (الخطوط الزرقاء) التي قد تؤدي إلى تقارب أعلى Ig. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: سير العمل لتحليل SHM من intron JH4 في GCBCs معزولة عن PPs. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: توصيف المركبات الكيميائية العالمية PP. (أ)العدد الإجمالي لخلايا PP من WT و AID-/- الفئران (n = 4 لكل نمط جيني). تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن الوسط. (ب) النسبة المئوية ل B220+PNAHI GCBCs التي تم الحصول عليها من PPs من WT و AID-/- الفئران (n = 4 لكل نمط جيني)36. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري عن المتوسط، *p<0.05 باستخدام اختبار t للطالب. (ج) مخططات FACS التمثيلية لفرز B220+PNAHI GCBCs من أجهزة الكمبيوتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل بيانات تسلسل JH4 سانجر. (أ)نماذج من محاذاة تسلسل بيانات تسلسل سانجر لمنتج JH4 PCR من WT (أعلى) و AID-/- (أسفل) GCBCs إلى التسلسل الجينومي المرجعي (NG_005838) ، وهو التسلسل مباشرة تحت علامات التجزئة المرقم. تم إنشاء التحالفات باستخدام أوميغا كلوستال. (ب)Electropherogram من بيانات تسلسل سانجر عالية الجودة، والتي عرضت قمم متميزة لكل قاعدة. (ج)الكتروفيروغرام لبيانات التسلسل منخفضة الجودة، والتي أظهرت قمم غامضة وقواعد غير محددة (N). يجب أن يكون النيوكليوتيدات الموضحة باللون الأحمر مشروحة يدويا في الملف النصي التسلسلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: تحليل الطفرات في إنترون JH4 في WT و AID-/- GCBCs. (أ)يتم تلخيص العدد الإجمالي للانتقال (الأحمر) والتحول (الأزرق) الطفرات في A، C، G، و T القواعد لكل النمط الجيني في الجداول. يشار إلى العدد الإجمالي للتسلسلات التي تم تحليلها أسفل الجدول. (ب)يتم تصوير عدد الطفرات لكل amplicon PCR لكل النمط الجيني في المخططات الدائرية. تم تعديل هذا الرقم من Choi et al.36 حقوق الطبع والنشر 2020. الرابطة الأمريكية لعلماء المناعة ، وشركة الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
كوكتيل تلطيخ لGCBCs | الحجم: 500 ميكرولتر | ||
الأجسام المضادة أو صبغ | فلوروفور | التخفيف | ميكرولتر |
B220 | PE | 1000 | 0.5 |
ستريبتافيدين | APC-eفلور780 | 500 | 1 |
DAPI | N/A | 500 | 1 |
الجدول 1: تلطيخ الكوكتيلات لGCBCs. تم استخدام مزيج من الأجسام المضادة المشار إليها أو الصبغة (المشار إليها بالخط المائل) في التخفيفات المحددة لتلطيخ خلايا PP في 500 ميكرولتر لقياس التدفق الخلوي.
بقع واحدة للتعويض | الحجم: 500 ميكرولتر | ||
الأجسام المضادة أو صبغ | فلوروفور | التخفيف | ميكرولتر |
B220 | PE | 1000 | 0.5 |
B220 | APC-eفلور780 | 750 | 0.67 |
DAPI | N/A | 500 | 1 |
الجدول 2: ضوابط بقعة واحدة للتعويض. واستخدمت الأجسام المضادة B220 المترافقة مع الفلوروفوريس المشار إليها لضوابط وصمة عار واحدة للتعويض عن التداخل الطيفي.
#1 PCR | ||||
الكاشف | حجم | ظروف دورة الحرارة | ||
5x المخزن المؤقت | 4 ميكرولتر | 1 | 95 درجة مئوية | 3 دقائق |
10 mM dNTP | 2 ميكرولتر | 2 | 94 درجة مئوية | 30 ثانية |
10 ميكرومتر J558FR3Fw | 1 ميكرولتر | 3 | 55 درجة مئوية | 30 ثانية |
10 ميكرومتر VHJ558.2 | 1 ميكرولتر | 4 | 72 درجة مئوية | 1:30 دقيقة |
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | 0.25 ميكرولتر | دورة 2-4 9x | ||
دنا | x (توحيد العينة الأقل تركيزا) | |||
H2O | إلى 20 ميكرولتر | 5 | 72 درجة مئوية | 5 دقائق |
تمييع PCR المنتج 1:5 في H2O قبل الشروع في PCR #2 |
الجدول 3: PCR المتداخلة من intron JH4. مكونات PCR وظروف الترموسيكلر لأول تفاعل تضخيم. تمييع أول منتج PCR 1:5 بالماء واستخدام 1 ميكرولتر من هذا التخفيف لPCR الثاني.
#2 PCR | ||||
الكاشف | حجم | ظروف دورة الحرارة #2 | ||
5x المخزن المؤقت | 4 ميكرولتر | 1 | 94 درجة مئوية | 3 دقائق |
10 mM dNTP | 2 ميكرولتر | 2 | 94 درجة مئوية | 30 ثانية |
10 ميكرومتر VHJ558.3 | 1 ميكرولتر | 3 | 55 درجة مئوية | 30 ثانية |
10 ميكرومتر VHJ558.4 | 1 ميكرولتر | 4 | 72 درجة مئوية | 30 ثانية |
بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | 0.25 ميكرولتر | دورة 2-4 21x | ||
المخفف PCR # 1 | 1 ميكرولتر | |||
H2O | إلى 20 ميكرولتر | 5 | 72 درجة مئوية | 5 دقائق |
الجدول 4: مكونات PCR وظروف دورة الحرارة ل PCR الثاني.
الكاشف | حجم |
2x المخزن المؤقت | 10 ميكرولتر |
جهاز PCR منقى | x (توحيد العينة الأقل تركيزا) |
بلازميد مع نهايات حادة | 1 ميكرولتر |
T4 الحمض النووي ليغاز | 1 ميكرولتر |
H2O | إلى 20 ميكرولتر |
حضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أو بين عشية وضحاها في 16ºC |
الجدول 5: رد فعل الربط. مكونات ربط من تنقية JH4 intron PCR المنتج في البلازميد.
المخزن المؤقت ل FACS |
الحرارة تعطيل FBS في 56 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل الاستخدام. ملحق برنامج تلفزيوني، درجة الحموضة 7.4 (جيبكو، #10010049) مع 2.5٪ (v/v) من FBS المعطل حراريا. يخزن عند درجة حرارة 4°C. |
مخزن استخراج الحمض النووي (100 mM Tris pH 8.0, 0.1 M EDTA, 0.5٪ (ث/v) SDS) |
أضف 50 مل من 1 M Tris pH 8.0 و 100mL من 0.5 M EDTA و 12.5 مل من 20٪ SDS. أضف الماء المقطر إلى 500 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة. |
TE المخزن المؤقت (10 mM تريس pH 8.0، 1 mM EDTA) |
أضف 2.5 مل من 1 M Tris pH 8.0 و 500 مل من 0.5 M EDTA. أضف الماء المقطر إلى 250 مل. تخزين في درجة حرارة الغرفة. |
الجدول 6: وصفات العازلة.
قائمة أوليغونوكليوتيدات | ||
J558FR3Fw | 5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3' | |
VHJ558.2 | 5'-CTGGACTTTCGGTGGTGGTG-3' | |
VHJ558.3 | 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3' | |
VHJ558.4 | 5'-تكتاغاكاجاكاكتاك-3' |
الجدول 7: أوليغونوكليوتيدات المستخدمة في المقايسة.
الشكل التكميلي 1: صورة هلام الآغاروز التمثيلية بعد الانتهاء من الخطوة 5.4. تم حل المنتج JH4 إينترون PCR المتداخلة على هلام agarose 1.5٪ وتم استئصال amplicon 580 bp. WT PP يشير إلى أن WT PP GCBC الحمض النووي الجينومي كان يستخدم كنموذج لأول PCR والإيدز PP يشير إلى أن AID-/- PP GCBC الحمض النووي الجينومي تم استخدامه كنموذج لأول PCR. ɸ يشير إلى عدم وجود عنصر تحكم PCR قالب و - يشير إلى أنه لم يتم تحميل أي شيء في بئر هلام agarose. الممر الأخير يظهر سلم الحمض النووي 100 نقطة أساس. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الرقم.
إن توصيف SHM داخل تسلسل ترميز IgH و IgL V لمحتوى الخلية B غير المتجانس يمثل تحديا ، نظرا لأن كل خلية B تعيد تنظيم شرائح ترميز V بشكل فريد أثناء إعادة دمج V(D)J34. في هذه الورقة، نصف طريقة لتحديد الطفرات في إنترون JH4 من GCBCs. وJH4 intron، الذي يقع 3 'من الجزء الأخير J الترميز في مكان IgH، ويستخدم كبديل لSHM من المناطق V (الشكل 1)31،33،34،35. لفهرسة هذه الطفرات intron JH4 وتقييم كيفية الجينات محددة تؤثر على إنتاج أو نمط الطفرات، يتم تحليل PP GCBCs على وجه التحديد. هذه الخلايا تتراكم JH4 intron الطفرات نتيجة للتحفيز المزمن عن طريق الكائنات الحية المجهرية المعوية53. وعلاوة على ذلك، فإن B220+PNAHI GCBCs من أجهزة الكمبيوتر من الفئران غير المحصنة لديها أطياف الطفرة التي تقارن مع GCBCs splenic من الحيوانات المحصنة54،55. ومع ذلك، لا يمكن ربط الطفرات في intron JH4 إلى نضوج تقارب Ig لأن هذه الطفرات هي غير الترميز.
لتحديد ما إذا كان SHM يغير تقارب Ig ، يجب تحصين الفئران intraperitoneally مع مستضد ، مثل NP (4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl) المقترنة CGG (الدجاج غاما الجلوبيولين) أو KLH (ثقب المفتاح limpet hemocyanin)56. في وقت لاحق، يمكن تنقية مرنا من B220 splenic+السلطة الوطنيةالفلسطينية مرحبا GCBCs لفحص SHM داخل VH186.2، V الترميز exon أن يعترف في معظم الأحيان NP وتحور بعد NP-CGG أو NP-KLH التحصين31،57،58،59،60. وقد تميزت طفرة من التربتوفان-33 إلى اليوسين في VH186.2 لزيادة تقارب Ig تصل إلى 10 أضعاف59,60، وبالتالي, مؤشر واحد أن SHM واختيار كلون قد ولدت تقارب عالية Ig. قياس NP7- و NP20 محددة مصل Ig titers بواسطة ELISA وحساب نسبة NP7/NP20 محددة Ig أثناء التطعيم وثائق أيضا Ig تقارب النضج الناتج عن SHM من المناطق V17,21,36. يمكن استخدام كل من هذه المقايسات لربط SHM داخل تسلسل الترميز VH186.2 مع التغييرات في نضج تقارب Ig الخاص ب NP.
وسواء استخدمت الحيوانات المحصنة أو غير المحصنة لتحليل SHM من VH186.2 أو إنترون JH4، يجب تحديد GCBCs بدقة. نحن نقدم نهجا قائما على FACS لعزل B220+PNAHI GCBCs. بدلا من ذلك، Fas وغير كبريتات α2-6-sialyl-LacNAc مستضد، والتي يتم التعرف عليها من قبل الأجسام المضادة GL761،62،63،64، ويمكن أيضا أن تستخدم لعزل GCBCs، والتي يتم تحديدها على أنها B220 + Fas+GL7+65 أو CD19 + Fas+GL7+37. GL7 التعبير يعكس عن كثب السلطة الوطنية الفلسطينية في GCBCs تنشيط الغدد الليمفاوية64،65،66. بالإضافة إلى استخدام علامات الأجسام المضادة الخاصة ب GCBCs ، يجب أن تزيد كوكتيلات التلطيخ من إثارة الفلوروفور والكشف عن علامة بيولوجية مع تقليل التداخل الطيفي لانبعاثات الفلورسينس. وينبغي الكشف عن المستضدات التي أعرب عنها في مستويات منخفضة مع الأجسام المضادة التي يتم اقترانها إلى fluorophore مع مضان الانبعاثات قوية67. تم تحسين بروتوكول التلطيخ الموصى به للتحليل على فرز الخلايا المجهز بأربعة أشعة ليزر (405nm و 488nm و 561nm و 633nm) و 12 مرشحات؛ ومع ذلك، تختلف تكوينات التصفية وتوافر الليزر بين مقاييس الخلايا. لتعديل البروتوكول وفقا للكواشف وتوافر المعدات ، يشار القارئ إلى موارد إضافية ، مشاهدي الطيف على الإنترنت ونشر الأدب67،68،69،70،71،72،73. يتطلب بروتوكول التلطيخ متعدد الألوان الموصوف هنا تعويضا عن التداخل الطيفي لضمان أن مجموعات الخلايا المفرزة هي GCBCs بدلا من الكشف غير الدقيق عن انبعاثات الفلورسينس. B220 بمثابة عنصر تحكم تلطيخ مفيدة ل FACS وصفها (الجدول 1B) لأن PPs سيكون لها مجموعات مميزة B220 السلبية والإيجابية (الشكل 3C)، والذي يسمح بالتعويض المناسب من التداخل الطيفي. وينبغي استخدام استراتيجية الصياغة الواردة في الشكل 3C كمبدأ توجيهي. قد تختلف مؤامرات قياس التدفق الخلوي اعتمادا على ظروف التلطيخ وإعدادات قياس الخلايا. ومع ذلك، ينبغي أن يكون 4-10٪ من الخلايا الحية B220+السلطةالوطنية الفلسطينية HI 35، 52.
يجب التحقق من صحة جميع الطفرات داخل intron JH4 من PP GCBCs لضمان أن الطفرات الملاحظة تعكس حقا SHM وليس قطعة أثرية من PCR أو التسلسل. AID-/- يمكن أن تكون الخلايا B بمثابة عنصر تحكم سلبي مفيد عند فحص النمط الظاهري SHM في نماذج الماوس المتحولة الأخرى لأن هذه الخلايا لا يمكن إكمال SHM17،19. معدل طفرة intron JH4 في الإيدز-/- GCBCs (1.66x10-5 الطفرات / bp)20،21،36،37،38،5 0،74 هو مماثل لمعدل الخطأ من البوليميراز عالية الدقة (5.3x10-7 الفرعية / قاعدة / مضاعفة)51،52 التي تستخدم لتضخيم الحمض النووي في PCR المتداخلة. إذا لم تتوفر أجهزة AID-/- الفئران، فقارن نمط الطفرات الملحوظة وتكرارها بالأدبيات المنشورة. تتراكم مناطق Ig V 10-3 -10-4 طفرات لكل قسم ثنائي أساسي ، وهو ما يزيد بنحو 106أضعاف عن معدل طفرة اللوتشي الجيني الآخر73،75. قد تختلف النتائج مع عمر الحيوان76. بدلا من ذلك، B220+PNALO الخلايا، الذي يمثل غير GCBCs، يمكن استخدامها كسيطرة سلبية في غياب الإيدز-/- الفئران52. إذا كان تردد الطفرة في WT GCBCs أقل من المتوقع، قد يتم تمثيل تسلسل الجراثيم WT JH4 intronic بشكل غير متناسب. في هذه الحالة، تأكد من أن GCBCs كانت ملطخة وفرزها بشكل مناسب ومركبات ثنائي الفينيل متعدد الكلور خالية من التلوث بالجراثيم WT JH4 intron. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تحليل بيانات التسلسل الخام في الكتروفيروغرام بدقة للتأكد من أن الطفرات في بيانات نص التسلسل ليست قطعا أثرية من أخطاء التسلسل. على سبيل المثال، قد تقلل نتائج تسلسل Sanger الرديئة من موثوقية بيانات التسلسل(الشكل 4). هذا التحكم في جودة بيانات تسلسل سانجر سيزيد من دقة والاستنساخ لتحليل طفرة intron JH4.
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
نشكر تاسوكو هونجو على الإيدز-/- الفئران. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني المعني بصحة الأقليات والتفاوتات الصحية (5G12MD007603)، والمعهد الوطني للسرطان (2U54CA132378)، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة (1SC1GM132035-01).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |
Tags
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved