Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Представлено здесь является анализ для количественной соматической гипермутации в иммуноглобулин тяжелых цепных генов локус с использованием зародышевых клеток центра В из патчей мыши Пейер.
В зародышевых центрах лимфоидных органов, зрелые В-клетки изменяют их выраженный иммуноглобулин (Ig), вводя неоплатенные мутации в переменное кодирование экзонов ig тяжелых и легких цепных генных локусов. Этот процесс соматической гипермутации (SHM) требует фермента активации индуцированной цитидина деаминазы (AID), который преобразует дезоксицитидины (C), в дезоксиуридины (U). Обработка НЕСОВМЕСТИМЫХ несоответствий в мутации базовым иссечением и несоответствующей ремонтной дорожкой вводит новые последовательности кодирования Ig, которые могут привести к более высокому сродству Ig. Мутации в генах AID или ДНК могут блокировать или значительно изменять типы мутаций, наблюдаемых в локусах Ig. Мы описываем протокол количественной оценки интрон мутаций JH4, который использует флуоресценцию активированной сортировки клеток (FACS), ПЦР и секвенирования Sanger. Хотя этот анализ непосредственно не измеряет созревание сродства Ig, это свидетельствует о мутациях в переменных последовательностях кодирования Ig. Кроме того, эти методы используют общие методы молекулярной биологии, которые анализируют мутации в последовательностях Ig нескольких клонов В-клеток. Таким образом, этот анализ является бесценным инструментом в изучении SHM и Ig диверсификации.
В-клетки, члены адаптивной иммунной системы, распознают и устраняют антигены, вырабатывая антитела, также известные как иммуноглобулины (Ig). Каждый Ig состоит из двух тяжелых (IgH) и двух легких (IgL) цепных полипептидов, которые проводятся вместе дисульфидными связями, чтобы сформировать характерную структуру формы "Y" Ig1. N-termini IgH и IgL составляют переменную (V) область каждого полипептида и вместе они образуют антиген связывания сайта Ig, в то время как постоянная область IgH придает эффектор функции Ig. Развитие B-клеток в костном мозге переставить V кодирования экзонов IgH и IgL в процессе, известном как V (D)J рекомбинации2,3,4. Транскрипция рекомбинированного V exons, в сочетании с соответствующими постоянными экзонами региона, образует мРНК, которая переводится в Ig.
Зрелые В-клетки, выражаюющие мембрану связаны Ig, также известный как рецептор В-клеток (BCR), циркулируют во вторичные лимфоидные органы, такие как селезенка, лимфатический узел, или патчи Пейера, где они обследуют среду для антигенов и взаимодействуют с другими клетками иммуннойсистемы 1. В зародышевых центрах (GC) вторичных лимфоидных органов, B клетки, которые признают антиген через BCR становятся активированными. С помощью фолликулярных дендритных клеток и фолликулярных помощников Т-клеток, активированные В-клетки могут размножаться и дифференцироваться в плазменные клетки и клетки памяти, которые являются важными эффекторами надежного иммунного ответа5,6,7,8,9. Кроме того, эти активированные В-клетки могут проходить вторичные процессы диверсификации генов Ig - рекомбинацию коммутатора класса (CSR) и соматическую гипермутацию (SHM). Во время КСО В-клетки обмениваются по умолчанию μ постоянной областью полипептида IgH с другой постоянной областью (γ, α, ε) через реакциюудаления ДНК-рекомбинации (рисунок 1). Это позволяет выражение различных постоянных exon и перевод нового Ig. Ячейка B перейдет от выражения IgM к другому изотипу (IgG, IgA, IgE). КСО изменяет функцию эффектора Ig, не изменяя его антигеннуюспецифичность 10,11,12. Тем не менее, во время SHM, B-клетки мутируют V кодирования регионов IgH иIgL,чтобы производство и выбор более высокого сродства Igs, которые могут более эффективно устранить антиген13,14,15 (Рисунок 1). Важно отметить, что и КСО, и SHM зависят от функции одного фермента: активация индуцированной цитидин деаминазы (AID)16,17,18. Люди и мыши, не хватает AID не может завершить КСО или SHM и настоящее время с повышенным IgM сыворотки титеры или Hyper-IgM17,19.
В КСО, AID deaminates дезоксицитидин (C) в повторяющихся регионах коммутатора, которые предшествуют каждой постоянной кодирования экзонов, превращая их в дезоксиуридины (U)20,21, что создает несовместимые базы сопряжения между дезоксиуридинов и дезоксигуанозинов (U:G). Эти U:G несоответствия преобразуются в двойной ДНК перерывов, которые необходимы для рекомбинации ДНК, либо путем ремонта иссечения базы (BER) или несоответствия ремонта (MMR)путь 22,23,24,25,26,27,28,29. В SHM AID deaminates C в эксонах кодирования V. Репликация через несоответствие U:G генерирует C:G к T: Переходные мутации, в то время как удаление базы uracil белком BER, гликозилаза ДНК uracil (UNG), до репликации ДНК производит как переход, так и трансверсиимутаций 16. Нулевые мутации в UNG значительно увеличивают C:G до T:A переходныхмутаций 21,22. Как и КСО, SHM требует дополнительных функций MMR и BER. Во время SHM MMR генерирует мутации в базовых парах A:T. Инактивирующие мутации в гомологии MutS 2 (MSH2)или полимеразе ДНК η (Pol) значительно уменьшают мутации на базах A:T и сложные мутации в MSH2 и Polе практически отменяет мутации на базах A:T21,30,31. В соответствии с критической ролью BER и MMR в преобразовании САИР-генерируемых U в переходные или трансверсионные мутации, мыши испытывают дефицит как для MSH2, так и для UNG (MSH2-/-UNG-/-)отображают только C:G к T:Переходные мутации в результате репликации через несоответствие U:G21.
Анализ SHM в регионах V кодирования остается сложным, потому что развивающиеся B-клетки могут рекомбинировать любой из экзонов кодирования V(D)J в локусе IgH и IgL1,2,4. Точный анализ этих уникально рекомбинированных и соматически мутировавших V областей требует идентификации и изоляции клонов В-клеток или Ig mRNA11,13. JH4 интрон, который является 3' из последних J кодирования экзон в локусе IgH, гавани соматических мутаций из-за распространения мутаций 3' из V промоутер32,33,34 и, следовательно, часто используется в качестве суррогатного маркера для SHM в V регионах31,35 (Рисунок 1). Чтобы экспериментально выяснить, как конкретные гены или генетические мутации изменить SHM моделей или ставок, JH4 интрон может быть секвенирован из патчей Пейера (PP) герминального центра B клеток (GCBCs), которые проходят высокие показатели SHM36,37,38. GCBCs можно легко определить и изолировать с флуоресцентно спряженными антителамипротив маркеров поверхности клетки (B220 и PNAHI)17,39.
Представлен подробный протокол для характеристики интронных мутаций JH4 в PP GCBCs у мышей с использованием комбинации FACS (сортировка активированных клеток флуоресценции), ПЦР и секвенированияСэнгера (рисунок 2).
Все мыши-мутанты были сохранены на фоне C57BL/6. Для всех экспериментов использовались возрастные (2-5 месяцев) мыши мужского и женского пола. Мужство и эксперименты с мышами проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Городским колледжем Нью-йоркского институционального комитета по уходу за животными и использованию.
1. Вскрытие патчей Пейера
2. Изоляция клеток для FACS
3. Окрашивание ГКБК для FACS
4. Извлечение ДНК из ГХФУ
5. JH4 интрон последовательность усиления и анализа
Цитометрия потока
Зрелые В-клетки циркулируют в зародышевые центры, где они проходят сродство созревания, клонального расширения, идифференциации в плазме или клеткипамяти 40,41,42,43,44. Эти GCBCs могут быть определены многочисленные маркеры поверхности клеток, в том числе высокое выражение рецептора CD45R/B220 и связывание арахисового агглютинина (PNA)45,46. Чтобы изолировать активированные ГХК, PP-клетки были окрашены антителами против В220, конъюгированными с фикоэритроном (PE) и биотинилированным ПНА, а затем стрептавидином, спряженным с APC-eFluor780. Мертвые клетки были ликвидированы с помощью флуоресцентных 4',6-Diamidino-2-фенилиндол (DAPI) красителя, который окрашивает нуклеиновую кислоту умирающих илимертвых клеток 47,48. Окрашенные клетки были впоследствии проанализированы и отсортированы с помощью цитометрии потока. PPs состоял из 80% B220и ячеек 49,50. WT PPs содержат в среднем 4 х 106 ячеек на мышь(рисунок 3A). Приблизительно 8% клеток WT PP были B220иPNAHI, что в два раза меньше, наблюдаемого в AID-/ - ( Рисунок 3B). Таким образом, после сортировки было получено 0,3-0,6х 10 6 B220 и PNAHI GCBCs, которых было достаточно для анализа мутаций в интроне JH4.
Анализ последовательности JH4
JH4 интрон был усилен вложенных ПЦР с использованием общих VHJ558 семьи грунтовки (J558FR3Fw и VHJ558.2), а затем JH4 интронохватывающихгрунтовки VHJ558.3 и VHJ558.435,37. Из 105 уникальных последовательностей, полученных из WT GCBCs, в общей сложности было обнаружено 226 мутаций(рисунок 5A). Анализ спектра мутации GCBC у мышей WT показал диапазон переходов и трансверсий со скоростью 4 х 10-3 мутаций/bp, который был рассчитан путем деления общего числа мутировавших баз на общее количествооснований,которыебыли секвенированы 32,36,37,38. Кроме того, каждый продукт JH4 PCR от WT GCBCs содержал 1-25 мутаций(рисунок 5B), где несколько мутаций часто находились на однойпоследовательности 33,36. Только две мутации были выявлены в 113 AID-/- последовательностях(рисунок 5A). AID-/- B-клетки продемонстрировали 1,66 х 10-5 мутаций/bp, что было значительно ниже, чем WT B клеток (p lt;0.05)36 и сравнивает с погрешностью высокой точности полимеразы (5,3 х 10-7 sub/base/doubling)51,52. Таким образом, AID-/- B-клетки служили полезным негативным контролем для этого анализа.
Рисунок 1: Схема локуса гена IgH и регионов, на которые нацелена AID во время КСО и ШМ. Красная планка указывает на интрон 580 bp JH4, который является 3' перестановки VDJH4 и анализируется в этом протоколе. В КСО деаминация интронных регионов коммутаторов, зависящих от AID, способствует образованию DSB, что позволяет удаление рекомбинации и экспрессию нового изотипа антител (IgM to IgE). Во время SHM, V регионов (серые ящики) накапливаются мутации (синие линии), которые могут привести к более высокой близости Ig. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Рабочий процесс для анализа SHM интрона JH4 в GCBCs изолированы от PPs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Характеристика ГКБК ПП. (A)Общее количество pp клеток от WT и AID-/- мышей (n q 4 в генотип). Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение от среднего. (B) Процент B220иPNAHI GCBCs, полученных от PPs WT и AID-/- мышей (n No 4 на генотип)36. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение от среднего, «p'lt;0.05» с помощью тестов студента. (C) Представитель FACS участков для сортировки B220иPNAHI GCBCs от ПК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Анализ данных последовательности JH4 Sanger. (A) Пример последовательности выравнивания данных последовательности Sanger продукта JH4 PCR от WT (вверху) и AID-/- (внизу) GCBCs к последовательности справки геномной (NG_005838), которая последовательность сразу под пронумероваваемые метки тика. Выравнивания были созданы с использованием Clustal Omega. (B)Электроферограмма высококачественных данных последовательности Sanger, которые отображали различные пики для каждой базы. (C)Электроферограмма низкого качества данных последовательности, которые показали неоднозначные пики и неопределенные основания (N). Нуклеотид, показанный красным цветом, должен быть вручную аннотирован в текстовом файле последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Анализ мутаций в интроне JH4 в WT и AID-/- GCBCs. (A)Общее количество переходных (красных) и трансверсийных (голубых) мутаций в базах A, C, G и T для каждого генотипа обобщено в таблицах. Общее количество анализируемых последовательностей указано ниже таблицы. (B)Количество мутаций на ПЦР ампликона для каждого генотипа изображено на кругообразной диаграмме. Эта цифра была изменена с Чой и др.36 Авторское право 2020. Американская ассоциация иммунологов, Inc Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.
Окрашивание Коктейль для GCBCs | Объем: 500 мкл | ||
Антитела или краситель | Флюорофор | разбавление | КЛ |
B220 | PE | 1000 | 0.5 |
Стрептавидин | БТР-эФлюор780 | 500 | 1 |
ДАПИ | N/A | 500 | 1 |
Таблица 1: Окрашивание коктейлей для GCBCs. Коктейль из указанных антител или красителя (указанный в литий)в указанных разбавлениях были использованы для окрашивания клеток PP в 500 йл для цитометрии потока.
Одиночные пятна для компенсации | Объем: 500 мкл | ||
Антитела или краситель | Флюорофор | разбавление | КЛ |
B220 | PE | 1000 | 0.5 |
B220 | БТР-эФлюор780 | 750 | 0.67 |
ДАПИ | N/A | 500 | 1 |
Таблица 2: Одиночные элементы управления пятнами для компенсации. Антитела B220, конъюгированные с указанными флюорофорами, использовались для одного контроля пятен для компенсации спектрального перекрытия.
ПЦР #1 | ||||
реагент | том | Условия термоциклера | ||
5x Буфер | 4 йл | 1 | 95 КК | 3 мин. |
10 мМ дНТП | 2 МЛ | 2 | 94 КК | 30 сек |
10 МКМ J558FR3Fw | 1 йл | 3 | 55 КК | 30 сек |
10 МКМ VHJ558.2 | 1 йл | 4 | 72 КК | 1:30 мин |
Полимераза ДНК высокой верности | 0,25 МЛ | Цикл 2-4 9x | ||
ДНК | x (стандартизация наименее концентрированной выборки) | |||
H2O | до 20 мкл | 5 | 72 КК | 5 мин. |
Разбавить ПЦР продукт 1:5 в H2O, прежде чем переступить к ПЦР #2 |
Таблица 3: Вложенный ПЦР интрона JH4. Компоненты ПЦР и условия термоциклера для первой реакции усиления. Разбавить первый продукт ПЦР 1:5 водой и использовать 1 МКЛ этого разбавления для второго ПЦР.
ПЦР #2 | ||||
реагент | том | Термоциклер Условия #2 | ||
5x Буфер | 4 йл | 1 | 94 КК | 3 мин. |
10 мМ дНТП | 2 МЛ | 2 | 94 КК | 30 сек |
10 МКМ VHJ558.3 | 1 йл | 3 | 55 КК | 30 сек |
10 МКМ VHJ558.4 | 1 йл | 4 | 72 КК | 30 сек |
Полимераза ДНК высокой верности | 0,25 МЛ | Цикл 2-4 21x | ||
Разбавленный ПЦР-1 | 1 йл | |||
H2O | до 20 мкл | 5 | 72 КК | 5 мин. |
Таблица 4: Компоненты ПЦР и термоциклерные условия для второго ПЦР.
реагент | том |
2x Буфер | 10 йл |
Очищенный ПЦР | x (стандартизация наименее концентрированной выборки) |
Плазмид с тупыми концами | 1 йл |
T4 Лигас ДНК | 1 йл |
H2O | до 20 мкл |
Инкубационный при температуре комнаты в течение 5 минут или на ночь при температуре 16oC |
Таблица 5: Реакция лигации. Компоненты для перевязки очищенного продукта JH4 intron PCR в плазмиду.
Буфер FACS |
Тепло инактивировать FBS при температуре 56 градусов по Цельсию в течение одного часа до использования. Дополнение PBS, рН 7.4 (Gibco, #10010049) с 2,5% (v/v) тепловой инактивированной FBS. Хранить при 4 градусах Цельсия. |
Буфер извлечения ДНК (100 мМ Трис рН 8,0, 0,1 М ЭДТА, 0,5% (ж/в) SDS) |
Добавьте 50 мл 1 M Tris pH 8.0, 100mL 0.5 M EDTA, и 12.5 mL 20% SDS. Добавьте дистиллированную воду до 500 мл. Хранить при комнатной температуре. |
TE Буфер (10 мМ Трис рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) |
Добавьте 2,5 мл 1 M Tris pH 8.0 и 500 мл 0.5 M EDTA. Добавьте дистиллированную воду до 250 мл. Хранить при комнатной температуре. |
Таблица 6: Буферные рецепты.
Список олигонуклеотидов | ||
J558FR3Fw | 5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3' | |
VHJ558.2 | 5'-CTGGACTTCGGTTTGGTG-3' | |
VHJ558.3 | 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3' | |
VHJ558.4 | 5'-TCTCTAGACCAACTAC-3' |
Таблица 7: Олигонуклеотиды, используемые в анализе.
Дополнительная цифра 1: Представитель агарозы гель изображение после завершения шага 5.4. JH4 интрон вложенных ПЦР продукт был решен на 1,5% агарозный гель и 580 bp amplicon был вырезан. WT PP указывает, что геномная ДНК WT PP GCBC использовалась в качестве шаблона для первого ПЦР и AID PP указывает на то, что геномнаяДНК AID-/- PP GCBC использовалась в качестве шаблона для первого ПЦР. ɸ указывает на отсутствие шаблона управления ПЦР и - указывает на то, что ничего не было загружено в колодец агарозного геля. Последняя полоса показывает 100 bp ДНК лестницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту цифру.
Характеристика SHM в igH и IgL V кодирования последовательностей неоднородной популяции клеток B представляет собой проблему, учитывая, что каждая клетка B однозначно реорганизует V сегментов кодирования во время рекомбинации V(D)J34. В этой статье мы описываем метод выявления мутаций в интроне JH4 ГХК. JH4 интрон, который расположен 3' из последнего сегмента кодирования J в локусе IgH, используется в качестве суррогата для SHM регионов V(рисунок 1)31,33,34,35. Чтобы каталогизировать эти интрон мутации JH4 и оценить, как конкретные гены влияют на производство или структуру мутаций, PP GCBCs специально анализируются. Эти клетки накапливают интрональные мутации JH4 в результате хронической стимуляции кишечной микробиотой53. Кроме того, B220иPNAHI GCBCs от PPs неиммунизированных мышей имеют спектр мутации, который сравнивается с splenic GCBCs от иммунизированныхживотных 54,55. Тем не менее, мутации в интроне JH4 не могут быть связаны с созреванием сродства Ig, потому что эти мутации не кодируются.
Чтобы определить, изменяет ли SHM сродство Ig, мыши должны быть иммунизированы intraperitoneally с антигеном, таких как NP (4-гидрокси-3-нитрофенилацетил) конъюгированных cGG (куриный гамма-глобулин) или KLH (ключ отверстие хрома hemocyanin)56. Впоследствии, мРНК может быть очищена отsplenic B220 и PNAHI GCBCs для изучения SHM в VH186.2, V кодирования экзон, который чаще всего распознает NP и мутировал после NP-CGG или NP-KLHиммунизации 31,57,58,59,60. Мутация триптофан-33 на лейцин в VH186.2 была охарактеризована для увеличения сродства Ig до 10 раз59,60 и,следовательно, один показатель того, что SHM и клональный отбор вызвал высокое сродство Ig. Измерение NP7- и NP20-специфических сывороток Ig титеры ELISA и расчета Ig-специфических NP7/NP20 соотношение в ходе иммунизации также документы Ig сродства созревания в результате SHM Vрегионов 17,21,36. Оба эти анализа могут быть использованы для корреляции SHM в VH186.2 кодирования последовательностей с изменениями в NP-специфических Ig сродства созревания.
Используются ли иммунизированные или неимунизированные животные для анализа SHM VH186.2 или интрона JH4, GCBCs должны быть точно идентифицированы. Мы представляем подход, основанный на FACS, чтобы изолировать B220 и PNAHI GCBCs. В качестве альтернативы, Фас и не сульфатных No 2-6-sialyl-LacNAc антиген, который признается антителом GL761,62,63,64,также могут быть использованы для изоляции GCBCs, которые определены как B220иFasNO GL7No 65 илиCD19 Выражение GL7 близко отражает PNA в активированных GCBCs лимфатических узлов64,65,66. В дополнение к использованию маркеров антител, характерных для ГХДК, окрашивание коктейлей должно максимизировать возбуждение флюорофора и обнаружение биомаркера при минимизации спектрального перекрытия флуоресцентного излучения. Антигены, выраженные на низких уровнях, должны быть обнаружены с антителом, которое спрягается с флюорофором с надежной флуоресценциейвыбросов 67. Рекомендуемый протокол окрашивания был оптимизирован для анализа на сортаторе клеток, оснащенном четырьмя лазерами (405 нм, 488 нм, 561 нм, 633 нм) и 12 фильтрами; однако конфигурации фильтров и доступность лазеров различаются между цитометрами. Для внесения изменений в протокол в соответствии с реагентом и наличием оборудования, читателю направляются дополнительные ресурсы, онлайн-зрители спектра и опубликованная литература67,68, 69,70,71,72,73. Многоцветный протокол окрашивания, описанный в настоящем, требует компенсации спектрального перекрытия для обеспечения того, чтобы отсортированная популяция клеток была ГХОК, а не неточного обнаружения флуоресцентного излучения. B220 служит полезным контролем окрашивания для описанного FACS(таблица 1B), потому что PPs будет иметь отличительные B220 отрицательных и положительных популяций (Рисунок 3C), что позволяет для соответствующей компенсации спектрального перекрытия. Стратегия гатинга, представленная на рисунке 3C, должна использоваться в качестве ориентира. Участки цитометрии потока могут варьироваться в зависимости от условий окрашивания и параметров цитометра. Тем не менее, 4-10% живых клеток должны быть B220иPNAHI 35, 52.
Все мутации в JH4 intron PP GCBCs должны быть проверены, чтобы убедиться, что наблюдаемые мутации действительно отражают SHM, а не артефакт ПЦР или секвенирования. AID-/- B-клетки могут служить полезным негативным контролем при изучении фенотипа SHM в других моделях мышей-мутантов, потому что эти клетки не могут завершить SHM17,19. Скорость мутации JH4 интрона в AID-/- GCBCs (1.66x10-5 мутаций/bp)20,21,36,37,38,50,74 сопоставима с погрешностью полимеразы высокой точности (5.3x10-7 sub/base/doubling)51,52, которая используется для усиления ДНК в вложенном ПЦР. Если AID-/- мыши недоступны, сравните наблюдаемую модель мутации и частоту с опубликованной литературой. Ig V регионов накапливаются 10-3-10-4 мутаций на базовую пару деления, что примерно в 106раз выше, чем скорость мутации других генныхлокусов 73,75. Результаты могут варьироваться в зависимости от возраста животного76. Кроме того, B220иPNALO клетки, которые марки не-GCBCs, могут быть использованы в качестве отрицательного контроля в отсутствие AID-/- мышей 52. Если частота мутаций в WT GCBCs ниже, чем ожидалось, ВТ зародышевой JH4 intronic последовательность может быть непропорционально представлены. В этом случае убедитесь, что ГХДК были окрашены и отсортированы надлежащим образом, а ПЦР свободны от загрязнения интроном WT germline JH4. Кроме того, необработанные данные секвенирования в электроферограммах должны быть тщательно проанализированы, чтобы убедиться, что мутации в текстовых данных последовательности не являются артефактами ошибок секвенирования. Например, плохие результаты секвенирования Sanger могут снизить надежность данных последовательности(рисунок 4). Такой контроль качества данных последовательности Sanger повысит точность и воспроизводимость анализа интрон мутаций JH4.
Авторов нечего раскрывать.
Мы благодарим Тасуку Хонджо за ПОМОЩЬ-/- мышей. Эта работа была поддержана Национальным институтом по вопросам здоровья меньшинств и неравенства в области здравоохранения (5G12MD007603), Национальным институтом рака (2U54CA132378) и Национальным институтом общих медицинских наук (1SC1GM132035-01).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved