Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Presenteras här är en analys för att kvantifiera somatisk hypermutation inom immunglobulin tunga kedjan gen locus med germinal centrum B celler från mus Peyers fläckar.
Inom germinal centers av lymfoida organ, mogna B celler ändra deras uttryckt immunglobulin (Ig) genom att införa otemplat mutationer i variabel kodning exons av Ig tunga och lätta kedjan gen lokus. Denna process av somatisk hypermutation (SHM) kräver enzym aktivering-inducerad cytidindeaminas (AID), som omvandlar deoxycytidiner (C), till deoxyuridiner (U). Bearbetning av AID-genererade U:G-missmatchningar i mutationer av basen excision och missmatchning reparation vägar introducerar nya Ig kodning sekvenser som kan producera en högre affinitet Ig. Mutationer i AID- eller DNA-reparationsgener kan blockera eller väsentligt förändra de typer av mutationer som observerats i Ig lokus. Vi beskriver ett protokoll för att kvantifiera JH4 intron mutationer som använder fluorescens aktiverad cell sortering (FACS), PCR och Sanger sekvensering. Även om denna analys inte direkt mäter Ig affinitet mognad, det är vägledande för mutationer i Ig variabel kodning sekvenser. Dessutom använder dessa metoder vanliga molekylärbiologiska tekniker som analyserar mutationer i Ig-sekvenser av flera B-cellkloner. Således är denna analys ett ovärderligt verktyg i studien av SHM och Ig diversifiering.
B-celler, medlemmar av det adaptiva immunsystemet, känner igen och eliminerar antigener genom att producera antikroppar, även kända som immunglobuliner (Ig). Varje Ig består av två tunga (IgH) och två lätta (IgL) kedjepolypeptider, som hålls samman av disulfidbindningar för att bilda den karakteristiska "Y" formstrukturen i Ig1. N-termini av IgH och IgL omfattar variabel (V) regionen för varje polypeptid och tillsammans bildar de antigen bindande platsen för Ig, medan den konstanta regionen IgH ger effektor funktionen av Ig. Utveckla B-celler i benmärgen omorganisera V-kodningsexonerna av IgH och IgL i en process som kallas V(D)J rekombination2,3,4. Transkription av de rekombinerade V-exonerna, i kombination med respektive konstanta region exoner, bildar mRNA som översätts till Ig.
Mogna B-celler som uttrycker en membranbunden Ig, även känd som en B-cellsreceptor (BCR), cirkulerar till sekundära lymfoida organ, såsom mjälte, lymfkörtel eller Peyers fläckar, där de undersöker miljön för antigener och interagerar med andra celler i immunsystemet1. Inom germinala centra (GC) av sekundära lymfoida organ aktiveras B-celler som känner igen antigen genom BCR. Med hjälp av follikulära dendritiska celler och follikulära hjälpare T-celler kan aktiverade B-celler sedan föröka sig och differentiera till plasma- och minnesceller, som är viktiga effektorer av ett robustimmunsvar 5,6,7,8,9. Dessutom kan dessa aktiverade B-celler genomgå sekundära Ig-gendiversifieringsprocesser - klassomkopplarrekombination (CSR) och somatisk hypermutation (SHM). Under CSR utbyter B-celler standard μ konstant region i IgH-polypeptiden med en annan konstant region (γ, α, ε) genom en DNA-deletional-rekombinationsreaktion (Figur 1). Detta möjliggör uttryck av en annan konstant exon och översättning av en ny Ig. B-cellen växlar från att uttrycka IgM till en annan isotyp (IgG, IgA, IgE). CSR ändrar Ig:s effektorfunktion utan att ändra dess antigenspecifikitet10,11,12. Under SHM muterar dock B-cellerna V-kodningsregionerna IgH och IgL för att möjliggöra produktion och val av högre affinitetSgs, vilket mer effektivt kan eliminera ett antigen13,14,15 ( figur1). Viktigt är att både CSR och SHM är beroende av ett enzyms funktion: aktiveringsinducerad cytidindeaminas (AID)16,17,18. Människor och möss som har brist på AID kan inte slutföra CSR eller SHM och presentera med förhöjda IgM serum titers eller Hyper-IgM17,19.
I CSR deaminerar AID deoxycytidiner (C) i de repetitiva switchregionerna som föregår varje konstant kodning exoner, omvandlar dem till deoxyuridiner (U)20,21, vilket skapar omaka basparning mellan deoxyuridin och deoxyguanosiner (U:G). Dessa U:G-missmatchningar omvandlas till de dubbelsträngade DNA-pauserna, som krävs för DNA-rekombination, antingen genom reparation av basexcision (BER) eller mmr-väg22, 23,24,25,26,27,28,29. I SHM deaminerar AID C inom V-kodningsexonerna. Replikering över U:G-missmatchning genererar C:G till T:A övergångsmutationer, medan avlägsnande av uracilbasen av BER-proteinet, uracil DNA glykosylas (UNG), före DNA-replikation ger både övergångs- och transversionsmutationer16. Null mutationer i UNG ökar avsevärt C:G till T:A övergångsmutationer21,22. I likhet med CSR kräver SHM de kompletterande rollerna mmr och ber. Under SHM genererar MMR mutationer vid A:T-baspar. Inaktivera mutationer i MutS homology 2 (MSH2) eller DNA-polymeras η (Polη) minskar signifikant mutationer vid A:T-baser och sammansatta mutationer i MSH2 och Polη avskaffar praktiskt taget mutationer vid A:Tbaser 21,30,31. I överensstämmelse med den kritiska rollen för BER och MMR vid konvertering av AID-genererade U till övergångs- eller transversionsmutationer visar möss som saknar både MSH2 och UNG(MSH2-/-UNG-/-) endast C:G till T:A övergångsmutationer som härrör från replikering över U:G-missmatchningen21.
Analysen av SHM i V-kodningsregioner är fortfarande komplicerad eftersom utveckling av B-celler kan rekombinera någon av V(D)J-kodningsexonerna i IgH och IgL lokus1,2,4. Noggrann analys av dessa unikt rekombinerade och somatiskt muterade V-regioner kräver identifiering och isolering av kloner av B-celler eller Ig mRNA11,13. JH4-intronen, som är 3' av den sista J-kodningsexonen i IgH-locus, hyser somatiska mutationer på grund av spridning av mutationer 3' av V-promotorn32,33,34 och används därför ofta som surrogatmarkör för SHM i V-regionerna31,35 ( Figur1). För att experimentellt klargöra hur specifika gener eller genetiska mutationer förändrar SHM-mönster eller hastigheter kan JH4-intronen sekvenseras från Peyers fläckar (PP) germinala B-celler (GCBCs), som genomgår höga nivåer av SHM36,37,38. GCBC kan lätt identifieras och isoleras med fluorescerande konjugerade antikroppar mot cellytans markörer (B220+PNAHI)17,39.
Ett detaljerat protokoll presenteras för att karakterisera JH4 intronmutationer i PP GCBCs från möss med hjälp av en kombination av FACS (fluorescensaktiverad cellsortering), PCR och Sanger sekvensering (Figur 2).
Alla mutanta möss bibehölls på en C57BL/6 bakgrund. Åldersmatchade (2-5 månader gamla) han- och honmöss användes för alla experiment. Djurhållning och experiment med möss utfördes enligt protokoll som godkänts av The City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Dissekering av Peyers plåster
2. Cellisolering för FACS
3. Färgning av GCBCs för FACS
4. DNA-extraktion från GCBCs
5. JH4 intronsekvensförstärkning och analys
Flödescytometri
Mogna B-celler cirkulerar till germinala centra där de genomgår affinitetsmognad, klonurexpansion och differentiering i plasma- ellerminnesceller 40,41,42,43,44. Dessa GCBCs kan identifieras av många cell ytmarkörer, inklusive högt uttryck för CD45R/B220 receptorn och bindning av jordnöts agglutinin (PNA)45,46. För att isolera aktiverade GCBCs var PP-celler färgade med anti-B220 antikroppar konjugerade till phycoerythrin (PE) och biotinylated-PNA, följt av streptavidin konjugerade till APC-eFluor780. Döda celler eliminerades med fluorescerande 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) färgämne, som fläckar nukleinsyran av döende eller döda celler47,48. De färgade cellerna analyserades och sorterades därefter via flöde cytometri. PPs bestod av ~80% B220+ celler49,50. WT PPs innehåller i genomsnitt 4 x 106 celler per mus (Figur 3A). Ungefär 8% av WT PP-cellerna var B220+PNAHI, vilket är hälften av det antal som observerats i AID-/ - ( Figur3B). Således erhölls 0,3-0,6 x 106 B220+PNAHI GCBCs efter sortering, som var tillräckliga för att analysera mutationer i JH4 intron.
JH4-sekvensanalys
JH4-intronen förstärktes av en kapslad PCR med vanliga VHJ558-familjens primers (J558FR3Fw och VHJ558.2) följt av JH4 intron som spänner över primers VHJ558.3 och VHJ558.435,37. Av de 105 unika sekvenser som erhållits från WT GCBCs hittades totalt 226 mutationer (figur 5A). Analys av GCBC mutationsspektrum i WT möss visade en rad övergångar och omvandlingar med en hastighet av 4 x 10-3 mutationer/bp, som beräknades genom att dividera det totala antalet muterade baser med det totala antalet baser som varsekvenserade 32,36,37,38. Dessutom innehöll varje JH4 PCR-produkt från WT GCBCs 1-25 mutationer (Figur 5B), där flera mutationer ofta hittades på ensekvens 33,36. Endast två mutationer identifierades i 113 AID-/- sekvenser ( Figur5A). AID-/- B-celler uppvisade 1,66 x 10-5 mutationer/bp, vilket var betydligt lägre än WT B-celler (p <0,05)36 och kan jämföras med felfrekvensen för polymeras med hög återgivning (5,3 x 10-7 sub/bas/fördubbling)51,52. Således fungerade AID-/- B-celler som en användbar negativ kontroll för denna analys.
Figur 1: Schematisk för genloket IgH och de regioner som AID riktar in sig på under CSR och SHM. Den röda stapeln anger den 580 bp JH4 intron som är 3' av VDJH4 omorganiseringar och analyseras i detta protokoll. I CSR främjar AID-beroende deamination av intronic switch-regioner (Sμ och Sε) DSB-bildandet som möjliggör deletional-rekombination och uttryck för en ny antikroppsisottyp (IgM till IgE). Under SHM ackumulerar V-regioner (grå lådor) mutationer (blå linjer) som kan leda till högre affinitet Ig. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 2: Arbetsflöde för att analysera SHM för JH4-intronen i GCBCs som isolerats från PPs. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Karakterisering av PP GCBCs. (A) Totalt antal PP-celler från WT och AID-/- möss (n = 4 per genotyp). Felstaplar representerar standardavvikelse från medelvärdet. B)Procentandel B220+PNAHI GCBCs erhållna från PPs av WT och AID-/- möss (n = 4 per genotyp)36. Felstaplar representerar standardavvikelse från medelvärdet , * p<0.05 med hjälp av deltagarens t-test. (C) Representativa FACS-tomter för att sortera B220+PNAHI GCBCs från datorer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Analys av JH4 Sanger-sekvensdata. (A) Provsekvensjusteringar av Sanger-sekvensdata för JH4 PCR-produkten från WT (överst) och AID-/- (nedre) GCBCs till referensgenomsekvensen (NG_005838), som är sekvensen omedelbart under de numrerade skalstrecken. Inriktningar genererades med hjälp av Clustal Omega. (B) Elektrosfärogram av högkvalitativa Sanger-sekvensdata, som visade distinkta toppar för varje bas. (C) Elektrosfärogram av lågkvalitativa sekvensdata, som visade tvetydiga toppar och ospecificerade baser (N). Nukleotid som visas i rött måste kommenteras manuellt i sekvenstextfilen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 5: Analys av mutationer i JH4-intronen i WT och AID-/- GCBCs. (A) Det totala antalet övergångsmutationer (röda) och transversionsmutationer (blå) vid A-, C-, G- och T-baser för varje genotyp sammanfattas i tabellerna. Det totala antalet analyserade sekvenser anges under tabellen. (B) Antalet mutationer per PCR-amplicon för varje genotyp visas i cirkeldiagrammen. Denna siffra har ändrats från Choi et al.36 Copyright 2020. American Association of Immunologists, Inc. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Färgningscocktail för GCBCs | Volym: 500 μL | ||
Antikropp eller färgämne | Fluorofor | Utspädning | Μl |
B220 (B220) | Pe | 1000 | 0.5 |
Streptavidin (streptavidin) | APC-eFluor780 | 500 | 1 |
DAPI (dapi) | Ej tillämpligt | 500 | 1 |
Bord 1: Färgning av cocktails för GCBCs. Cocktail av de angivna antikropparna eller färgämnet (indikerat i klystik) vid de angivna utspädningarna användes för att färga PP-celler i 500 μL för flödescytometri.
Enstaka fläckar för ersättning | Volym: 500 μL | ||
Antikropp eller färgämne | Fluorofor | Utspädning | Μl |
B220 (B220) | Pe | 1000 | 0.5 |
B220 (B220) | APC-eFluor780 | 750 | 0.67 |
DAPI (dapi) | Ej tillämpligt | 500 | 1 |
Tabell 2: Kontroller med en fläck mot ersättning. B220 antikroppar konjugerade till de angivna fluorforerna användes för enfärgade kontroller för att kompensera för spektral överlappning.
PCR-#1 | ||||
Reagens | Volym | Termocyklistförhållanden | ||
5x buffert | 4 μL | 1 | 95 °C | 3 min |
10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 sek |
10 μM J558FR3Fw | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 sek |
10 μM VHJ558,2 | 1 μL | 4 | 72 °C | 1:30 min |
DNA-polymeras med hög trohet | 0,25 μL | Cykel 2-4 9x | ||
Dna | x (standardisera till minst koncentrerat prov) | |||
H2O | till 20 μL | 5 | 72 °C | 5 min |
Späd PCR-produkt 1:5 i H2O innan du fortsätter till PCR-#2 |
Tabell 3: Kapslad PCR för JH4-intronen. PCR-komponenter och termocyklistförhållanden för den första förstärkningsreaktionen. Späd ut den första PCR-produkten 1:5 med vatten och använd 1 μL av denna utspädning för den andra PCR.
PCR-#2 | ||||
Reagens | Volym | Termocyklistförhållanden #2 | ||
5x buffert | 4 μL | 1 | 94 °C | 3 min |
10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 sek |
10 μM VHJ558,3 | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 sek |
10 μM VHJ558,4 | 1 μL | 4 | 72 °C | 30 sek |
DNA-polymeras med hög trohet | 0,25 μL | Cykel 2-4 21x | ||
Utspädd PCR #1 | 1 μL | |||
H2O | till 20 μL | 5 | 72 °C | 5 min |
Tabell 4: PCR-komponenter och termocyklistförhållanden för den andra PCR.Table 4: PCR components and thermocycler conditions for the second PCR.
Reagens | Volym |
2x buffert | 10 μL |
Renad PCR | x (standardisera till minst koncentrerat prov) |
Plasmid med trubbiga ändar | 1 μL |
T4 DNA-liga | 1 μL |
H2O | till 20 μL |
Inkubera vid rumstemperatur i 5 min eller över natten vid 16ºC |
Tabell 5: Ligationsreaktion. Komponenter för ligatur av den renade JH4 intron PCR-produkten i plasmiden.
FACS-buffert |
Värm inaktivera FBS vid 56 °C i en timme före användning. Tillägg PBS, pH 7,4 (Gibco, #10010049) med 2,5% (v/v) värmeinaktiverade FBS. Förvara vid 4°C. |
DNA-extraktionsbuffert (100 mM Tris pH 8,0, 0,1 M EDTA, 0,5% (w/v) SDS) |
Tillsätt 50 ml 1 M Tris pH 8,0, 100 mL 0,5 M EDTA och 12,5 ml 20% SDS. Tillsätt destillerat vatten till 500 ml. Förvara i rumstemperatur. |
TE-buffert (10 mM Tris pH 8,0, 1 mM EDTA) |
Tillsätt 2,5 ml 1 M Tris pH 8,0 och 500 ml 0,5 M EDTA. Tillsätt destillerat vatten till 250 ml. Förvara i rumstemperatur. |
Tabell 6: Buffertrecept.
Oligonukleotider Lista | ||
J558FR3Fw | 5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3' | |
VHJ558.2 | 5'-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3' | |
VHJ558.3 | 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3' | |
VHJ558,4 | 5'-TCTCTAGACAGCAACTAC-3' |
Tabell 7: Oligonukleotider som används i analysen.
Kompletterande figur 1: Representativ agarosgelbild efter avslutad steg 5.4. JH4 intron kapslade PCR produkt löstes på en 1,5% agarose gel och 580 bp amplicon var strukits. WT PP indikerar att WT PP GCBC genomiskt DNA användes som mall för den första PCR och AID PP indikerar att AID-/- PP GCBC genomiskt DNA användes som mall för den första PCR. ɸ indikerar ingen mall PCR-kontroll och - indikerar att ingenting laddades i agarosegelens brunn. Det sista körfältet visar en DNA-stege på 100 bp. Klicka här för att ladda ner den här siffran.
Karakterisering av SHM inom IgH- och IgL V-kodningssekvenserna för en heterogen B-cellpopulation utgör en utmaning, med tanke på att varje B-cell unikt omorganiserar V-kodningssegment under V(D)J-rekombination34. I detta dokument beskriver vi en metod för att identifiera mutationer i JH4 intron av GCBCs. JH4-intronen, som ligger 3' av det sista J-kodningssegmentet i IgH-locus, används som surrogat för SHM i V-regioner(figur 1)31,33,34,35. För att katalogisera dessa JH4 intronmutationer och bedöma hur specifika gener påverkar produktionen eller mönstret av mutationer analyseras PP GCBCs specifikt. Dessa celler ackumulerar JH4 intronmutationer som ett resultat av kronisk stimulering av intestinala mikrobiota53. Dessutom har B220+PNAHI GCBCs från PPs av oimmuniserade möss ett mutationsspektra som jämförs med splenic GCBCs från immuniserade djur54,55. Mutationer i JH4 intron kan dock inte korreleras till Ig affinity mognad eftersom dessa mutationer är icke-kodning.
För att avgöra om SHM förändrar Ig-affiniteten bör möss immuniseras intraperitoneally med ett antigen, såsom NP (4-hydroxy-3-nitrophenylacetyl) konjugerat till CGG (kyckling gamma globulin) eller KLH (nyckelhål limpet hemocyanin)56. Därefter kan mRNA renas från mjält B220+PNAHI GCBCs för att undersöka SHM inom VH186.2, V-kodningsexon som oftast känner igen NP och muteras efter NP-CGG eller NP-KLH immunisering31,57,58,59,60. Mutation av tryptofan-33 till en leucin i VH186.2 har karakteriserats för att öka Ig affinitet upp till 10-faldiga59,60 och är därför en indikator på att SHM och klonurvalet har genererat hög affinitet Ig. Mätning av NP7- och NP20-specifika serum Ig-titrar av ELISA och beräkning av det Ig-specifika NP7/NP20-förhållandet under immuniseringens gång dokumenterar också Ig affinitetsmognad till följd av SHM iV-regionerna 17,21,36. Båda dessa analyser kan användas för att korrelera SHM inom VH186.2 kodningssekvenser med förändringar i NP-specifik Ig affinity mognad.
Oavsett om immuniserade eller oimmuniserade djur används för att analysera SHM av VH186.2 eller JH4 intron, måste GCBCs identifieras noggrant. Vi presenterar en FACS-baserad metod för att isolera B220+PNAHI GCBCs. Alternativt kan fas och icke-sulfaterad α2-6-sialyl-LacNAc-antigen, som känns igen av GL7-antikroppen61,62,63,64, också användas för att isolera GCBCs, som identifieras som B220+Fas+GL7+65 eller CD19+Fas+GL7+37. GL7 uttryck speglar nära PNA i aktiverade GCBCs av lymfkörtlarna64,65,66. Förutom att använda antikroppsmarkörer som är specifika för GCBCs, bör färgcocktails maximera excitationen av en fluorofor och detektion av en biomarkör samtidigt som spektral överlappning av fluorescensutsläpp minimeras. Antigener uttryckta vid låga nivåer bör detekteras med en antikropp som konjugeras till en fluorfor med en robust emissionsfluorescens67. Det rekommenderade färgningsprotokollet optimerades för analys på en cellsorterare utrustad med fyra lasrar (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) och 12 filter; Filterkonfigurationer och lasertillgänglighet varierar dock mellan cytometrar. För att ändra protokollet enligt reagens och utrustningstillgänglighet hänvisas läsaren till ytterligare resurser, onlinespektrumvisare och publiceradlitteratur 67,68,69,70,71,72,73. Det flerfärgsfärgningsprotokoll som beskrivs häri kräver ersättning för spektral överlappning för att säkerställa att de sorterade cellpopulationerna är GCBC snarare än felaktig upptäckt av fluorescensutsläpp. B220 fungerar som en användbar färgningskontroll för de beskrivna FACS (tabell 1B) eftersom PPs kommer att ha distinkta B220 negativa och positiva populationer (figur 3C), vilket möjliggör lämplig ersättning av spektralöverlappning. Den gatingstrategi som presenteras i figur 3C bör användas som riktlinje. Flödescytometridiagrammen kan variera beroende på färgningsförhållandena och cytometerinställningarna. Ändå bör 4-10% av levande celler vara B220+PNAHI 35, 52.
Alla mutationer inom JH4 intron av PP GCBCs måste valideras för att säkerställa att de observerade mutationerna verkligen återspeglar SHM och inte en artefakt av PCR eller sekvensering. AID-/- B-celler kan fungera som en användbar negativ kontroll när man undersöker SHM fenotyp i andra mutanta musmodeller eftersom dessa celler inte kan slutföra SHM17,19. JH4 intron mutationshastighet i AID-/- GCBCs (1.66x10-5 mutationer/bp)20,21,36,37,38,50är74 jämförbar med felfrekvensen för polymeras med hög återgivning (5,3x10-7 sub/base/doubling)51,52 som används för att förstärka DNA i det kapslade PCR. Om AID-/- möss inte är tillgängliga, jämför det observerade mutationsmönstret och frekvensen med den publicerade litteraturen. Ig V-regioner ackumulerar 10-3 -10-4 mutationer per baspardelning, vilket är ungefär 106gånger högre än mutationshastigheten hos andra gen lokus73,75. Resultaten kan variera med djurets ålder76. Alternativt kan B220+PNALO-celler, som markerar icke-GCBCs, användas som en negativ kontroll i avsaknad av AID-/- möss52. Om mutationsfrekvensen i WT GCBCs är lägre än förväntat kan WT-bakterien JH4 intronic sekvensen vara oproportionerligt representerad. I detta fall, se till att GCBCs färgades och sorteras på lämpligt sätt och PCR är fria från WT-bakterien JH4 intron kontaminering. Dessutom bör råsekvenseringsdata i elektrosfärogram analyseras noggrant för att säkerställa att mutationer i sekvenstextdata inte är artefakter av sekvenseringsfel. Till exempel kan dåliga Sanger-sekvenseringsresultat minska tillförlitligheten hos sekvensdata (figur 4). Denna kvalitetskontroll av Sanger-sekvensdata kommer att öka noggrannheten och reproducerbarheten av JH4-intronmutationsanalysen.
Författarna har inget att avslöja.
Vi tackar Tasuku Honjo för AID-/- möss. Detta arbete stöddes av National Institute on Minority Health and Health Differences (5G12MD007603), National Cancer Institute (2U54CA132378) och National Institute of General Medical Sciences (1SC1GM132035-01).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved