Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection
Burada, fare Peyer'in yamalarından germinal merkez B hücrelerini kullanarak immünoglobulin ağır zincir gen lokusu içindeki somatik hipermütasyonu ölçmek için bir test sunulmaktadır.
Lenfoid organların germinal merkezlerinde, olgun B hücreleri, Ig ağır ve hafif zincir gen loci'nin değişken kodlama eksonlarına untemplated mutasyonlar sokarak ifade edilen immünoglobulinlerini (Ig) değiştirir. Bu somatik hipermütasyon (SHM) işlemi, deoksisitidinleri (C) deoksisidinlere (U) dönüştüren enzim aktivasyonuna bağlı stidin deaminazını (AID) gerektirir. AID tarafından oluşturulan U:G uyuşmazlıklarının baz eksizyon ve uyuşmazlık onarım yolları tarafından mutasyonlara işlenmesi, daha yüksek bir benzeşim Ig üretebilecek yeni Ig kodlama dizileri sunar. AID veya DNA onarım genlerindeki mutasyonlar, Ig loci'de gözlenen mutasyon türlerini engelleyebilir veya önemli ölçüde değiştirebilir. Floresan aktif hücre sıralama (FACS), PCR ve Sanger dizilimini kullanan JH4 intron mutasyonlarını ölçmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu test ig benzeşimi olgunlaşmasını doğrudan ölçmese de, Ig değişken kodlama dizilerindeki mutasyonların göstergesidir. Ek olarak, bu yöntemler birden fazla B hücre klonunun Ig dizilerindeki mutasyonları analiz eden yaygın moleküler biyoloji tekniklerini kullanır. Bu nedenle, bu tahlil SHM ve Ig çeşitlendirme çalışmasında paha biçilmez bir araçtır.
Adaptif bağışıklık sisteminin üyeleri olan B hücreleri, immünoglobulinler (Ig) olarak da bilinen antikorlar üreterek antijenleri tanır ve ortadan kaldırır. Her Ig, Ig1'inkarakteristik "Y" şekil yapısını oluşturmak için disülfit bağları tarafından bir arada tutulan iki ağır (IgH) ve iki hafif (IgL) zincir polipeptitten oluşur. IgH ve IgL'nin N-termini, her polipeptitin değişken (V) bölgesini oluşturur ve birlikte Ig'nin antijen bağlama bölgesini oluştururken, IgH'nin sabit bölgesi Ig'nin efektör işlevini oluşturur. Kemik iliğinde B hücreleri geliştirmek, IgH ve IgL'nin V kodlama eksonlarını V(D)J rekombinasyon2,3,4olarak bilinen bir işlemde yeniden düzenler. Yeniden birleştirilen V ekzonlarının transkripsiyonu, ilgili sabit bölge eksonları ile birleştiğinde, Ig'ye çevrilen mRNA'yı oluşturur.
B hücre reseptörü (BCR) olarak da bilinen zara bağlı bir Ig'yi ifade eden olgun B hücreleri, dalak, lenf nodu veya Peyer'in yamaları gibi ikincil lenfoid organlara dolaşır, burada antijenler için çevreyi inceler ve bağışıklık sisteminin diğer hücreleriyle etkileşime girer1. sekonder lenfoid organların germinal merkezleri (GC) içinde BCR yoluyla antijeni tanıyan B hücreleri aktive olur. Foliküler dendritik hücreler ve foliküler yardımcı T hücreleri tarafından yardım edilen aktif B hücreleri, daha sonra sağlam bir immün yanıtın önemli etkileri olan plazma ve hafıza hücrelerine çoğalabilir ve farklılaşabilir5, 6,7,8,9. Ek olarak, bu aktif B hücreleri ikincil Ig gen çeşitlendirme süreçlerinden geçebilir - sınıf anahtarı rekombinasyonu (KSS) ve somatik hipermütasyon (SHM). KSS sırasında B hücreleri, IgH polipeptitinin varsayılan μ sabit bölgesini dna silme-rekombinasyon reaksiyonu yoluyla başka bir sabit bölgeyle (γ, α, ε) değiştirir (Şekil 1). Bu, farklı bir sabit aksonun ifade edilmesine ve yeni bir Ig'nin çevirisine izin verir. B hücresi IgM'yi ifade etmekten başka bir izotipe (IgG, IgA, IgE) geçer. KSS, antijen özgüllüğünü değiştirmeden Ig'nin efektör işlevini değiştirir10,11,12. Bununla birlikte, SHM sırasında B hücreleri, bir antijeni daha etkili bir şekilde ortadan kaldırabilen daha yüksek benzeşimli Iglerin üretimini ve seçimini sağlamak için IgH ve IgL'nin V kodlama bölgelerini mutasyona uğratır13,14,15 ( Şekil1). Daha da önemlisi, hem KSS hem de SHM bir enzimin işlevine bağlıdır: aktivasyona bağlı sitidin deaminaz (AID)16,17,18. AID'de eksik olan insanlar ve fareler KSS veya SHM'yi tamamlayamaz ve yükseltilmiş IgM serum titreleri veya Hyper-IgM17,19ile mevcut olamaz.
KSS'de, AID, her sabit kodlama eksonlarından önce gelen tekrarlayan anahtar bölgelerindeki deoksisitidinleri (C) deaminate eder, bunları deoxyuridines (U)20,21'edönüştürür,bu da deoksiyridinler ve deoksyguanosinler (U:G) arasında eşleşmeyen baz eşleştirmesi oluşturur. DNA rekombinasyonu için gerekli olan, taban eksizyon onarımı (BER) veya uyuşmazlık onarımı (MMR) yolu22 , 23,24,25 , 26,27,28,29. SHM'de AID, V kodlama ekzonları içindeki C'yi deaminate eder. U:G uyuşmazlığı boyunca replikasyon C:G'den T:A geçiş mutasyonlarına neden olurken, urasil tabanının BER proteini, urasil DNA glikosilaz (UNG) tarafından çıkarılması, DNA replikasyonundan önce hem geçiş hem de transversiyon mutasyonları üretir16. UNG'deki boş mutasyonlar C:G'yi T:A geçiş mutasyonlarına önemli ölçüde artırır21,22. KSS'ye benzer şekilde, SHM mmr ve BER'in tamamlayıcı rollerini gerektirir. SHM sırasında MMR, A:T baz çiftlerinde mutasyonlar oluşturur. MutS homology 2 (MSH2) veya DNA polimeraz η(Polφ)mutasyonlarını inaktive etmek, A:T bazlarındaki mutasyonları önemli ölçüde azaltır ve MSH2 ve Polφ'daki bileşik mutasyonlar A:T bazlarındaki mutasyonları neredeyse ortadan kaldırır21,30,31. AID tarafından oluşturulan U'yu geçiş veya transversiyon mutasyonlarına dönüştürmede BER ve MMR için kritik rol ile tutarlı olarak, hem MSH2 hem de UNG(MSH2-/-UNG-/-) için eksik olan fareler, U:G uyumsuzluğu21boyunca çoğaltmadan kaynaklanan yalnızca C:G ila T:A geçiş mutasyonlarını görüntüler.
V kodlama bölgelerinde SHM analizi karmaşık kalır, çünkü gelişmekte olan B hücreleri IgH ve IgL loci 1,2,4'tekiV(D)J kodlama eksonlarından herhangi birini yeniden birleyebilir. Bu benzersiz bir şekilde yeniden birleştirilmiş ve somatik olarak mutasyona uğramış V bölgelerinin doğru analizi, B hücrelerinin veya Ig mRNA11 , 13klonlarının tanımlanmasını ve izolasyonunu gerektirir. IgH lokusundaki son J kodlama eksonunun 3' 'ü olan JH4 intron, V promotörü 32 , 33,34'ün 3'mutasyonlarının yayılması nedeniyle somatik mutasyonları barındırır ve bu nedenle V bölgelerinde 31, 35 (Şekil 1)SHM için taşıyıcı işaretleyici olarak sıklıkla kullanılır. Belirli genlerin veya genetik mutasyonların SHM örüntülerini veya oranlarını nasıl değiştirdiğini deneysel olarak anlamak için JH4 intron, Yüksek SHM36 , 37,38oranlarından geçen Peyer'in yamalarından (PP) germinal merkez B hücrelerinden (GCBC' ler) sıralanabilir. GCBC'ler hücre yüzey belirteçlerine karşı floresan konjuge antikorlarla kolayca tanımlanabilir ve izole edilebilir (B220+PNAHI)17,39.
PP GCBC'lerdeki JH4 intron mutasyonlarını farelerden FACS (floresan aktif hücre sıralama), PCR ve Sanger diziliminin bir kombinasyonu kullanılarak karakterize etmek için ayrıntılı bir protokol sunulmuştur (Şekil 2).
Tüm mutant fareler C57BL /6 arka plan üzerinde muhafaza edildi. Tüm deneyler için yaşa uygun (2-5 aylık) erkek ve dişi fareler kullanıldı. New York Şehir Koleji Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre farelerin hayvancılığı ve deneyleri yapıldı.
1. Peyer yamalarının diseksiyonu
2. FACS için hücre yalıtımı
3. FACS için GCBC'lerin Boyanması
4. GCBC'lerden DNA ekstraksiyonu
5. JH4 intron dizi amplifikasyonu ve analizi
Akış sitometrisi
Olgun B hücreleri, benzeşim olgunlaşması, klonal genişleme ve plazma veya hafıza hücrelerine farklılaşmaya maruz kaldıkları germinal merkezlere dolaşır40 , 41,42,43,44. Bu GCBC'ler, CD45R/ B220 reseptörünün yüksek ekspresyişi ve yer fıstığı aglutinin (PNA)45,46'nınbağlanması da dahil olmak üzere çok sayıda hücre yüzeyi belirteci ile tanımlanabilir. Aktif GCBC'leri izole etmek için PP hücreleri, fitoerythrin (PE) ve biyotiniled-PNA'ya konjuge edilen anti-B220 antikorları ile lekelendi ve ardından APC-eFluor780'e konjuge streptavidin verildi. Ölü hücreler, ölmekte olan veya ölen hücrelerin nükleik asidini lekeleyen floresan 4',6-Diamidino-2-Fenilindole (DAPI) boyası kullanılarak elimine edilmiştir47,48. Lekeli hücreler daha sonra akış sitometrisi ile analiz edildi ve sıralandı. PP'ler ~% 80 B220+ hücre49,50'den oluşuyordu. WT PP'ler fare başına ortalama 4 x 106 hücre içerir (Şekil 3A). WT PP hücrelerinin yaklaşık % 8'i AID-/ - ( Şekil3B)'degözlenen sayının yarısı olan B220+PNAHIidi. Böylece, JH4 intronunda mutasyonları analiz etmek için yeterli olan sıralamadan sonra0.3-0.6 x 10 6 B220+PNAHI GCBC'ler elde edildi.
JH4 Sıra Analizi
JH4 intron, ortak VHJ558 aile primerleri (J558FR3Fw ve VHJ558.2) kullanılarak iç içe geçmiş bir PCR ile güçlendirildi ve ardından VHJ558.3 ve VHJ558.435,37astarlarını kapsayan JH4 intron. WT GCBC'lerden elde edilen 105 benzersiz diziden toplam 226 mutasyon bulundu (Şekil 5A). WT farelerindeki GCBC mutasyon spektrumunun analizi, mutasyona uğramış bazların toplam sayısının32 , 36 , 37 ,38sıralı toplam baz sayısına bölünmesiyle hesaplanan 4 x 10-3mutasyon / bp oranında bir dizi geçiş ve transversiyon gösterdi. Ek olarak, WT GCBC'lerden gelen her JH4 PCR ürünü, bir dizi 33,36'da sık sık birden fazla mutasyon bulunan1-25mutasyon (Şekil 5B) içeriyordu. 113 AID-/- dizisinde sadece iki mutasyon tanımlanmıştır (Şekil 5A). AID-/- B hücreleri 1.66 x 10-5 mutasyon/bp, WT B hücrelerinden (p <0.05)36'dan önemli ölçüde düşüktü ve yüksek doğrulukta polimerazın hata oranıyla karşılaştırıldığında (5.3 x 10-7 alt/baz/iki katına çıkarma)51,52. Bu nedenle, AID-/- B hücreleri bu test için yararlı bir negatif kontrol görevi buldu.
Şekil 1: IGH gen lokusu ve KSS ve SHM sırasında AID tarafından hedeflenen bölgelerin şeması. Kırmızı çubuk, VDJH4 yeniden düzenlemelerinin 3' olan 580 bp JH4 intron'ını gösterir ve bu protokolde analiz edilir. KSS'de, intronik anahtar bölgelerinin (Sμ ve Sφ) AID'ye bağımlı deaminasyonu, silme-rekombinasyona ve yeni bir antikor izotipinin (IgM'den IgE'ye) ifade edilmesine izin veren DSB oluşumunu teşvik eder. SHM sırasında, V bölgeleri (gri kutular) daha yüksek benzeşim Ig'ye yol açabilecek mutasyonlar (mavi çizgiler) biriktirir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GP'lerden yalıtılmış GCBC'lerdeki JH4 intronunun SHM'sini analiz etmek için iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: PP GCBC'lerin karakterizasyonu. (A) WT ve AID-/- farelerden gelen toplam PP hücresi sayısı (genotip başına 4= 4). Hata çubukları ortalamadan standart sapmayı temsil eder. (B) WT ve AID-/- farelerin PC'lerinden elde edilen B220+PNAHI GCBC'lerin yüzdesi (n = genotip başına 4)36. Hata çubukları, öğrencinin t testini kullanarak ortalamadan standart sapmayı temsil eder, *p<0.05. (C) B220+PNAHI GCBC'leri PC'lerden sıralamak için temsili FACS çizimleri.
Şekil 4: JH4 Sanger sıra verilerinin analizi. (A) JH4 PCR ürününün Sanger sıra verilerinin WT (üstte) ve AID-/- (altta) GCBC'lerden referans genomik diziye (NG_005838) örnek dizi hizalamaları, numaralı onay işaretlerinin hemen altındaki sıradır. Hizalamalar Clustal Omega kullanılarak oluşturulmuştur. (B) Her taban için farklı zirveler gösteren yüksek kaliteli Sanger sıra verilerinin elektroferogramı. (C) Belirsiz tepeler ve belirtilmemiş bazlar (N) gösteren düşük kaliteli dizi verilerinin elektroferogramı. Kırmızı ile gösterilen nükleotid, sıralı metin dosyasında el ile açıklama eklenmelidir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: WT ve AID-/- GCBC'lerde JH4 intronunda mutasyonların analizi. (A) Her genotip için A, C, G ve T tabanlarındaki toplam geçiş (kırmızı) ve transversiyon (mavi) mutasyon sayısı tablolarda özetlenmiştir. Analiz edilen toplam sıra sayısı tablonun altında belirtilir. (B) Her genotip için PCR amplicon başına mutasyon sayısı pasta grafiklerde gösterilmiştir. Bu rakam Choi ve ark.36 Copyright 2020'den değiştirilmiştir. Amerikan İmmünologlar Birliği, Inc. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
GCBC'ler için Boyama Kokteyli | Hacim: 500 μL | ||
Antikor veya Boya | Florofor | Seyreltme | μL |
B220 | Pe | 1000 | 0.5 |
Streptavidin | APC-eFluor780 | 500 | 1 |
Demir | Yok | 500 | 1 |
Tablo 1: GCBC'ler için boyama kokteylleri. Belirtilen seyreltmelerde belirtilen antikorların veya boyanın (italik olarak belirtilir) kokteyli, akış sitometrisi için PP hücrelerini 500 μL'de boyamak için kullanıldı.
Tazminat için Tek Lekeler | Hacim: 500 μL | ||
Antikor veya Boya | Florofor | Seyreltme | μL |
B220 | Pe | 1000 | 0.5 |
B220 | APC-eFluor780 | 750 | 0.67 |
Demir | Yok | 500 | 1 |
Tablo 2: Tazminat için tek leke kontrolleri. Spektral çakışmayı telafi etmek için tek leke kontrolleri için belirtilen floroforlara konjuge edilen B220 antikorları kullanıldı.
PCR #1 | ||||
Reaktif | Birim | Termosikler Koşulları | ||
5x Arabellek | 4 μL | 1 | 95 °C | 3 dk |
10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 sn |
10 μM J558FR3Fw | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 sn |
10 μM VHJ558.2 | 1 μL | 4 | 72 °C | 1:30 dk |
Yüksek DoğrulukTA DNA polimeraz | 0,25 μL | Döngü 2-4 9x | ||
Dna | x (en az konsantre numuneye standartlaştırın) | |||
H2O | 20 μL'ye kadar | 5 | 72 °C | 5 dk |
PCR #2 geçmeden önce PCR ürününü H 2 O'da1:5seyreltin |
Tablo 3: JH4 intronunun iç içe PCR'ı. İlk amplifikasyon reaksiyonu için PCR bileşenleri ve termosikler koşulları. İlk PCR ürününü 1:5 su ile seyreltin ve ikinci PCR için bu seyreltmenin 1 μL'sini kullanın.
PCR #2 | ||||
Reaktif | Birim | Termosikler Koşullar #2 | ||
5x Arabellek | 4 μL | 1 | 94 °C | 3 dk |
10 mM dNTP | 2 μL | 2 | 94 °C | 30 sn |
10 μM VHJ558.3 | 1 μL | 3 | 55 °C | 30 sn |
10 μM VHJ558.4 | 1 μL | 4 | 72 °C | 30 sn |
Yüksek DoğrulukTA DNA polimeraz | 0,25 μL | Döngü 2-4 21x | ||
Seyreltilmiş PCR#1 | 1 μL | |||
H2O | 20 μL'ye kadar | 5 | 72 °C | 5 dk |
Tablo 4: İkinci PCR için PCR bileşenleri ve termosikler koşulları.
Reaktif | Birim |
2x Arabellek | 10 μL |
Saflaştırılmış PCR | x (en az konsantre numuneye standartlaştırın) |
Künt uçlu plazmid | 1 μL |
T4 DNA Ligase | 1 μL |
H2O | 20 μL'ye kadar |
Oda sıcaklığında 5 dakika veya gece boyunca 16ºC'de kuluçkaya yatır |
Tablo 5: Ligasyon reaksiyon. Saflaştırılmış JH4 intron PCR ürününün plazmid içine ligasyonu için bileşenler.
FACS Arabelleği |
Isı, FBS'yi kullanmadan önce bir saat boyunca 56 °C'de devre dışı bırakın. Ek PBS, pH 7.4 (Gibco, #10010049) ve %2.5 (v/v) ısı inaktive FBS. 4°C'de saklayın. |
DNA Ekstraksiyon Tamponu (100 mM Tris pH 8.0, 0.1 M EDTA, %0.5 (w/v) SDS) |
50 mL 1 M Tris pH 8.0, 100mL 0.5 M EDTA ve 12.5 mL% 20 SDS ekleyin. 500 mL'ye damıtılmış su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın. |
TE Tampon (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA) |
2,5 mL 1 M Tris pH 8,0 ve 500 mL 0,5 M EDTA ekleyin. 250 mL'ye damıtılmış su ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın. |
Tablo 6: Tampon tarifleri.
Oligonükleotidler Listesi | ||
J558FR3Fw | 5'-GCCTGACATCTGAGGACTCTGC-3' | |
VHJ558.2 | 5'-CTGGACTTTCGGTTTGGTG-3' | |
VHJ558.3 | 5'-GGTCAAGGAACCTCAGTCA-3' | |
VHJ558.4 | 5'-TCTAGACAGCAACTAC-3' |
Tablo 7: Testte kullanılan oligonükleotidler.
Ek Şekil 1: Adım 5.4 tamamlandıktan sonra temsili agarose jel görüntüsü. JH4 intron iç içe PCR ürünü% 1.5 agarose jel üzerinde çözüldü ve 580 bp amplicon eksize edildi. WT PP, WT PP GCBC genomik DNA'sının ilk PCR için şablon olarak kullanıldığını ve AID PP'nin aid-/- PP GCBC genomik DNA'nın ilk PCR için şablon olarak kullanıldığını gösterir. ɸ şablonsuz PCR kontrolünü gösterir ve - agarose jel kuyusuna hiçbir şeyin yüklenmemiş olduğunu gösterir. Son şeritte 100 bp DNA merdiveni var. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.
Heterojen bir B hücre popülasyonunun IgH ve IgL V kodlama dizileri içindeki SHM'yi karakterize etmek, her B hücresinin V(D)J rekombinasyonu34sırasında V kodlama segmentlerini benzersiz bir şekilde yeniden düzenlediği göz önüne alındığında bir zorluk sunar. Bu yazıda, GCBC'lerin JH4 intronunda mutasyonları tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. IgH lokusundaki son J kodlama segmentinin 3' 'ü bulunan JH4 intron, V bölgelerinin SHM'si için taşıyıcı olarak kullanılır (Şekil 1)31,33,34,35. Bu JH4 intron mutasyonlarını kataloglamak ve belirli genlerin mutasyonların üretimini veya düzenini nasıl etkilediğini değerlendirmek için PP GCBC'ler özellikle analiz edilir. Bu hücreler, bağırsak mikrobiyotası53tarafından kronik stimülasyonun bir sonucu olarak JH4 intron mutasyonlarını biriktirir. Ayrıca, bağışıklanmamış farelerin PC'lerinden B220+PNAHI GCBC'ler, bağışıklanmış hayvanlardan dalak GCBC'lerine kıyasla bir mutasyon spektrumlarına sahiptir54,55. Bununla birlikte, JH4 intronundaki mutasyonlar Ig benzeşimi olgunlaşması ile ilişkilendirilemez, çünkü bu mutasyonlar kodlama değildir.
SHM'nin Ig benzeşimini değiştirip değiştirmediğini belirlemek için, fareler CGG (tavuk gama globulin) veya KLH (anahtar deliği limpet hemocyanin)56'yakonjuge edilen NP (4-hidroksi-3-nitrophenylacetyl) gibi bir antijen ile intraperitoneally olarak bağışıklanmalıdır. Daha sonra, mRNA, NP'yi en sık tanıyan ve NP-CGG veyaNP-KLH bağışıklama 31 ,57 , 58 , 59,60'dan sonra mutasyona uğrayan V H186.2içindeki SHM'yi incelemek için dalak B220+PNAHI GCBC'lerden arındırılabilir. Triptofan-33'ün VH186.2'de bir lösin mutasyonu, Ig benzeşimini 10 kat59,60'a kadar artırdığı ve bu nedenle SHM ve klonal seçimin yüksek benzeşim Ig ürettiğinin bir göstergesi olduğu karakterize edilmiştir. NP7 ve NP20'ye özgü serum Ig titrelerinin ELISA tarafından ölçülmesi ve bağışıklama sırasında Ig'ye özgü NP7/NP20 oranının hesaplanması, V bölgelerinin SHM'sinden kaynaklanan Ig benzeşim olgunlaşmasını da belgelemektedir17,21,36. Her iki tahlil de VH186.2 kodlama dizilerindeki SHM'yi NP'ye özgü Ig benzeşimi olgunlaşmasındaki değişikliklerle ilişkilendirmek için kullanılabilir.
VH186.2'nin SHM'lerini veya JH4 intron'u analiz etmek için bağışıklanmış veya bağışıklanmamış hayvanlar kullanılsın, GCBC'ler doğru bir şekilde tanımlanmalıdır. B220+PNAHI GCBC'leri izole etmek için FACS tabanlı bir yaklaşım sunuyoruz. Alternatif olarak, GL7 antikoru 61 , 62 , 63,64 tarafından tanınan Fas vesülfatsızα2-6-sialyl-LacNAcantijeni, B220+Fas+GL7+65veya CD19+Fas+GL7+37olarak tanımlanan GCBC'leri izole etmek için de kullanılabilir. GL7 ifadesi, lenf düğümlerinin aktif GCBC'lerindePNA'yı yakındanyansıtır 64,65,66. GCBC'lere özgü antikor belirteçleri kullanmanın yanı sıra, boyama kokteylleri floroforun eksize edilmesini ve bir biyobelirtecinin algılanmasını en üst düzeye çıkarmalı ve floresan emisyonunun spektral çakışmasını en aza indirmelidir. Düşük seviyelerde ifade edilen antijenler, sağlam emisyon floresanlı bir florofora konjuge edilen bir antikor ile tespit edilmelidir67. Önerilen boyama protokolü, dört lazer (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) ve 12 filtre ile donatılmış bir hücre sıralayıcısı üzerinde analiz için optimize edilmiştir; ancak filtre konfigürasyonları ve lazer kullanılabilirliği sitometreler arasında değişiklik gösterir. Protokolü reaktif ve ekipman kullanılabilirliğine göre değiştirmek için, okuyucu ek kaynaklara, çevrimiçi spektrum izleyicilerine ve yayınlanan literatür67 , 68,69,70,71,72,73'eatıftabulunulmaktadır. Burada açıklanan çok renkli boyama protokolü, sıralanmış hücre popülasyonlarının floresan emisyonunun yanlış tespiti yerine GCB'ler olduğundan emin olmak için spektral çakışmanın telafisini gerektirir. B220, açıklanan FACS(Tablo 1B)için yararlı bir boyama kontrolü görevi görür, çünkü PP'ler spektral çakışmanın uygun şekilde telafisini sağlayan ayırt edici B220 negatif ve pozitif popülasyonlara (Şekil 3C) sahip olacaktır. Şekil 3C'de sunulan gating stratejisi kılavuz olarak kullanılmalıdır. Akış sitometrisi çizimleri boyama koşullarına ve sitometre ayarlarına bağlı olarak değişebilir. Bununla birlikte, canlı hücrelerin% 4-10'u B220+PNAHI 35, 52olmalıdır.
PP GCBC'lerin JH4 intron içindeki tüm mutasyonlar, gözlemlenen mutasyonların PCR veya dizilemenin bir eseri değil, SHM'yi gerçekten yansıttığından emin olmak için doğrulanmalıdır. AID-/- B hücreleri diğer mutant fare modellerinde SHM fenotipini incelerken yararlı bir negatif kontrol görevi görür, çünkü bu hücreler SHM 17 ,19'utamamlayamaz. AID-/- GCBC'lerde JH4 intron mutasyon oranı (1.66x10-5 mutasyon/bp)20,21,36,37,38,50 ,5074, iç içe geçmiş PCR'deki DNA'yı yükseltmek için kullanılan yüksek kaliteli polimerazın (5,3x10-7 alt/baz/iki katına çıkarma)51,52 hata oranıyla karşılaştırılabilir. AID-/- fareler mevcut değilse, gözlemlenen mutasyon patinatını ve sıklığını yayınlanan literatürle karşılaştırın. Ig V bölgeleri baz çifti bölünmesi başına 10-3-10 -4 mutasyon biriktirir, bu da diğer gen loci73,75'in mutasyon oranından yaklaşık 106kat daha yüksektir. Sonuçlar hayvanın yaşına göre değişebilir76. Alternatif olarak, GCBC olmayanları işaretleyen B220+PNALO hücreleri, AID -/- farelerin yokluğunda negatif kontrol olarak kullanılabilir52. WT GCBC'lerdeki mutasyon sıklığı beklenenden düşükse, WT germline JH4 intronik dizisi orantısız bir şekilde temsil edilebilir. Bu durumda, GCBC'lerin uygun şekilde boyanıp sıralandığını ve PCR'lerin WT germline JH4 intron kontaminasyonundan arındırıldığından emin olun. Ayrıca, sıralı metin verilerindeki mutasyonların sıralama hatalarının eserleri olmadığından emin olmak için elektroferogramlardaki ham sıralama verileri ayrıntılı olarak analiz edilmelidir. Örneğin, kötü Sanger sıralama sonuçları sıra verilerinin güvenilirliğini azaltabilir (Şekil 4). Sanger serisi verilerinin bu kalite kontrolü, JH4 intron mutasyon analizinin doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini artıracaktır.
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Tasuku Honjo'ya AID-/- fareler için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Azınlık Sağlığı ve Sağlık Eşitsizlikleri Enstitüsü (5G12MD007603), Ulusal Kanser Enstitüsü (2U54CA132378) ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (1SC1GM132035-01) tarafından desteklenmiştir.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 ml PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, mixed | USA Scientific | 1402-4708 | |
Ampicillin sodium salt | Fisher | BP1760-5 | |
APC-eFluor780 anti-CD45R/B220 | eBioscience | 47-0452-80 | clone RA3-6B2 |
BD FACSAria II | BD | 643186 | four lasers (405nm, 488nm, 561nm, 633nm) and 12 filters (PacBlue (450/50), AmCyan (502LP; 530/30), SSC (488/10), FITC (502LP; 530/30), PerCP-Cy5.5 (655LP; 695/40), PE (585/15), PE-Texas Red (600LP; 610/20), PE-Cy5 (630LP; 670/14), PE-Cy7 (735LP; 780/60), APC (660/20), Alexa700 (710LP; 730/45), APC-Cy7 (755LP; 780/60)) |
BD slip tip 1mL syringe | Fisher | 14-823-434 | sterile |
Biotinylated peanut agglutinin (PNA) | Vector Labs | B-1075-5 | |
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 664 | |
Corning Falcon test tube with cell strainer snap cap | Fisher | 08-771-23 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, dihydrochloride) | Fisher | D1306 | 0.5 mg/ml |
dNTP | NEB | N0447L | 10 mM |
ElectroMAX DH10B competent cells | Fisher | 18-290-015 | |
Falcon cell strainer 40mm | Fisher | 08-771-1 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (FACS tubes) | Fisher | 14-959-5 | |
Falcon round-bottom polystyrene tubes (capped) | Fisher | 149591A | |
Fetal bovine serum | R&D Systems (Atlanta Biologicals) | S11150 | |
Gibco phosphate buffered saline PBS pH 7.4 | Fisher | 10-010-049 | |
Glycogen | Sigma | 10901393001 | |
Lasergene Molecular Biology (MegAlign Pro) | DNA Star | version 15 | |
PE anti-CD45R/B220 | BD | 553090 | clone RA3-6B2 |
Proteinase K | Fisher | BP1700-100 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0491L | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
Seal-Rite 1.5mL microcentrifuge tubes | USA Scientific | 1615-5500 | |
Streptavidin APC-eFluor 780 Conjugate | eBioscience | 47-4317-82 | |
T4 DNA ligase | NEB | M020L | |
Thermo Scientific CloneJET PCR Cloning Kit | ThermoFisher | FERK1231 | |
Tissue culture plate 6 well | Fisher | 08-772-1B | sterile |
Unlabeled anti-mouse CD16/CD32 (Fc block), BD | Fisher | BDB553142 | Clone 2.4G2 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved