Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
يقدم هذا البروتوكول مقايسة المشيمية التي تنبت ، وهو نموذج سابق vivo للانتشار الأوعية الدموية الدقيقة. ويمكن استخدام هذا الفحص لتقييم المسارات التي تشارك في انتشار الأوعية الدقيقة المشيمية وتقييم العلاجات الدوائية باستخدام النوع البري وأنسجة الفئران المعدلة وراثياً.
إن تولد الأوعية المشيمية المرضي، وهو سمة بارزة من الضمور البقعي المرتبط بالعمر، يؤدي إلى ضعف البصر والعمى. تستخدم فحوصات الانتشار في الخلايا البطانية (EC) باستخدام خلايا البطايخ البطانية الدقيقة (HRMECs) أو الخلايا الإلكترونية الأولية المعزولة للشبكية (EC) على نطاق واسع في نماذج المختبر لدراسة تكوين الأوعية الدموية في الشبكية. ومع ذلك، فإن عزل الخلايا البطانية النقية في شبكية العين هو أمر صعب تقنيًا وقد يكون لدى الخلايا الإلكترونية للشبكية استجابات مختلفة لانتشار الخلايا البطانية المشيمية وتفاعلات الخلايا/الخلايا المختلفة. تم تطوير مقايسة المشيمية السابقة القابلة للاستنساخ للغاية كنموذج لانتشار الأوعية الدموية الدقيقة المشيمية. يتضمن هذا النموذج التفاعل بين الأوعية الدموية المشيمية (EC، الضامة، الضم) وظهارة صبغ الشبكية (RPE). يتم عزل الماوس RPE / choroid / explants Scleral واحتضانها في مستخرج الغشاء القاعدي الذي يقل عن عامل النمو (BME) (يوم 0). يتم تغيير المتوسطة كل يوم والآخر ويتم تحديد كمي براعم المشيمية في اليوم 6. يتم التقاط صور من إبتلول المشيمية الفردية مع مجهر المرحلة المقلوبة ويتم قياس مساحة تنبت باستخدام ماكرو شبه مؤتمتة المكونات في لبرنامج ImageJ المتقدمة في هذا المختبر. ويمكن استخدام هذا الاختبار التنبّعي السابق المستنسخ من الجسم الحي في تقييم المركبات للعلاج المحتمل وبحوث الأمراض الوعائية الدقيقة لتقييم المسارات المشاركة في انتشار السفن الدقيقة المشيمية باستخدام النوع البري وأنسجة الماوس المعدلة وراثياً.
يرتبط خلل التشتت الوعائي المشيرويدي مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر النيوفياز (AMD)1. المشيمية هي عبارة عن سرير الأوعية الدموية الدقيقة الموجود تحت ظهارة صبغ الشبكية (RPE). وقد تبين أن انخفاض تدفق الدم في المشيمية يرتبط مع تطور AMD2. العلاقة المعقدة بين بطانة الأوعية الدموية، RPE، الضامة، التحلل والخلايا الأخرى هي المسؤولة عن التوازن للأنسجة3،4،5. ولذلك، فإن وجود مقايسة مستنسخة النمذجة المشيمية microenvironment أمر بالغ الأهمية لدراسة أيه أمد neovascular.
يمكن أن تكمل فحوصات الخلايا الوعائية السابقة ف....
تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية الموصوفة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في مستشفى بوسطن للأطفال (ARCH البروتوكول رقم 19-04-3913R).
1- الإعداد
مقارنة بين النمو المشيمية التي تنبت في اليوم
نحن تشريح المشيمية مع صلبرة، جزءا لا يتجزأ من BME واستزراع لهم لمدة 6 أيام (الشكل 1). تم فحص المشيمية التي تنبت في فئران C57BL/6J من اليوم الثالث إلى اليوم السادس باستخدام المجهر وتم تحديد كمي مع SWIFT-Choroid طريقة تك?.......
تم دعم العمل من قبل المنح من مؤسسة مانبي سوزوكي السكري (YT)، مستشفى بوسطن للأطفال OFD/BTREC/CTREC كلية منحة التطوير الوظيفي، بوسطن مستشفى الأطفال مؤسسة طب العيون، جائزة تجريبية BCH، BCH مانتون مركز الزمالة، ومؤسسة الزرافة الصغيرة، ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG؛ إلى BC [CA1940/1-1])، NIH R24EY024868، EY017017، R01EY01717-13S1، EY030904-01، BCH IDDRC (1U54HD090255)، مؤسسة ماساتشوستس ليونز العين (LEHS).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved