En Ex Vivo Choroid Spirende Assay af okulær mikrovaskulær angiogenese

Denne protokol præsenterer choroid spiring assay, en ex vivo model af mikrovaskulær spredning. Denne analyse kan bruges til at vurdere veje involveret i prolifererende choroidal mikro fartøjer og vurdere narkotika behandlinger ved hjælp af vilde type og genetisk modificerede musevæv.

Patologisk choroidal angiogenese, en fremtrædende funktion af aldersrelateret makuladegeneration, fører til synsnedsættelse og blindhed. Endotelcelle (EF) spredningsanalyser ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC' er) eller isolerede primære nethinde-EC'er anvendes i vid udstrækning in vitro-modeller til undersøgelse af retinal angiogenese. Men, isolere ren murine retinale endotelceller er teknisk udfordrende og retinale ECs kan have forskellige spredning svar end choroidal endotelceller og forskellige celle / celle interaktioner. En meget reproducerbar ex vivo choroidal spiring assay som en model af choroidal mikrovaskulær spredning blev udviklet. Denne model omfatter samspillet mellem choroid vaskulatur (EF, makrofager, pericytter) og retinale pigment epitel (RPE). Muse-RPE/choroid/scleral explants isoleres og inkuberes i vækstfaktorredrimeret basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium ændres hver anden dag og choroid spiring kvantificeres på dag 6. Billederne af individuelle choroid explant er taget med en omvendt fase mikroskop og spiring område kvantificeres ved hjælp af en semi-automatiseret makro plug-in til ImageJ software udviklet i dette laboratorium. Denne reproducerbare ex vivo choroidal spiringsanalyse kan anvendes til at vurdere forbindelser til potentiel behandling og til mikrovaskulær sygdomsforskning for at vurdere veje, der er involveret i choroidal mikrokarprolifeion ved hjælp af vildtype og genetisk modificeret musevæv.

Choroidal angiogenese dysregulation er forbundet med neovaskulær aldersrelateret makuladegeneration (AMD)¹. Den choroid er en mikrovaskulær seng til stede under retinale pigment epitel (RPE). Det er blevet påvist, at nedsat blodgennemstrømning i choroid er forbundet med progression af AMD^2. Det indviklede forhold mellem vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homøostase^afvævet^3,4,5. Derfor er en reproducerbar analyse modellering choroidal mikromiljø er afgørende for studiet af neovaskulær A....

Alle beskrevne dyreforsøg blev godkendt af Udvalget for Institutionel Dyrepleje og -anvendelse på Boston Children's Hospital (ARCH-protokolnummer 19-04-3913R).

1. Forberedelse

1. Der tilsættes 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 U/ml) og 5 ml og 10 ml kommercielt tilgængelige kosttilskud til 500 ml komplet klassisk medium med serum. Aliquot 50 ml af mediet i første omgang.
   BEMÆRK: Tilbagelever ikke noget medium til lageret for at undgå kontaminering.
2. Sæt en aliquot .......

Sammenligning af choroid spirende vækst per dag

Vi dissekeret choroid med sclera, indlejret i BME og dyrkede dem i 6 dage(Figur 1). Choroid spiring i C57BL/6J mus fra dag 3 til dag 6 blev undersøgt med et mikroskop og kvantificeret med SWIFT-Choroid en semi-automatiseret kvantificering metode i ImageJ. I et repræsentativt tilfælde var det choroidalspiringsområde (de fartøjer, der strækker sig fra explanten, bortset fra selve explanten) 0,38.......

Den choroidal spirende assay hjælpemidler forskning i neovaskulær AMD^{9,10,18,19,20}. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker^17,21. Choroid explant omfatter EC'er, makrofager og pericytes¹⁷. I denne analyse samspillet mellem choroidal ECs og tilstødende c.......

Arbejdet blev støttet af Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Oftalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).