JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

Een Ex Vivo Choroid Sprouting Assay van Oculaire Microvasculaire Angiogenese

Published: August 6th, 2020

DOI:

10.3791/61677

1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, 3Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Pathologische choroidale angiogenese, een treffend kenmerk van leeftijdsgebonden maculadegeneratie, leidt tot gezichtsstoornissen en blindheid. Endotheelcel (EC) proliferatietesten met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) of geïsoleerde primaire retinale EC's worden veel gebruikt in vitro modellen om retinale angiogenese te bestuderen. Echter, isoleren van zuivere murine retinale endotheelcellen is technisch uitdagend en retinale ECs kunnen verschillende proliferatie reacties dan choroidale endotheelcellen en verschillende cel / cel interacties. Een zeer reproduceerbare ex vivo choroidale kiemen test als een model van choroidale microvasculaire proliferatie werd ontwikkeld. Dit model omvat de interactie tussen choroïde vasculatuur (EC, macrofagen, pericyten) en retinale pigment epitheel (RPE). Muis RPE/choroïde/scleral explants worden geïsoleerd en geïncubeerd in groeifactor-verminderde basale membraan extract (BME) (dag 0). Medium wordt om de andere dag veranderd en choroid ontkiemen wordt gekwantificeerd op dag 6. De beelden van individuele choroid explant worden genomen met een omgekeerde fase microscoop en het ontkiemen gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een semi-geautomatiseerde macro plug-in om de ImageJ software ontwikkeld in dit lab. Deze reproduceerbare ex vivo choroidale spruittest kan worden gebruikt om verbindingen voor potentiële behandeling te beoordelen en voor microvasculair ziekteonderzoek om trajecten te beoordelen die betrokken zijn bij de proliferatie van choroidale microvaten met behulp van wild type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.

Choroidale angiogenese dysregulatie wordt geassocieerd met neovasculaire leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. De choroïde is een microvasculair bed aanwezig onder het retinale pigment epitheel (RPE). Het is aangetoond dat verminderde bloedstroom in de choroid wordt geassocieerd met progressie van AMD2. De ingewikkelde relatie tussen vasculair endotheel, RPE, macrofagen, pericyten en andere cellen is verantwoordelijk voor de homeostase van het weefsel3,4,5. Daarom is een reproduceerbare test modellering choroidale micro-om....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee in het Boston Children's Hospital (ARCH protocolnummer 19-04-3913R).

1. Voorbereiding

  1. Voeg 5 mL Penicilline/Streptomycine (10000 U/mL) en 5 mL en 10 mL aan commercieel beschikbare supplementen toe aan 500 mL compleet klassiek medium met serum. Aliquot 50 mL van het medium in eerste instantie.
    LET OP: Breng geen medium terug naar de voorraad om besmetting te voorkomen.
  2. Zet .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Vergelijking van choroid ontkiemen groei per dag

We ontleed de choroid met sclera, ingebed in BME en gekweekt ze voor 6 dagen (Figuur 1). De chooïde die van dag 3 tot dag 6 in C57BL/6J muizen ontkiemde, werd met een microscoop onderzocht en gekwantificeerd met SWIFT-Choroid een semi-geautomatiseerde kwantificeringsmethode in ImageJ. In een representatief geval bedroeg het kiekkiemende gebied (de vaten die zich uitstrekken van de explant, met uitz.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De choroidale kiemen test helpt onderzoek in neovasculaire AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kunnen worden geïsoleerd van muizen, evenals ratten en mensen17,21. De choroid explant omvat ECs, macrofagen, en pericytes17. In deze test de interactie tussen choroïdale ECs en aangr.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het werk werd ondersteund door Subsidies van de Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship en Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; bc [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Foundation Eye (LEHS).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved