Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire

Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.

L’angiogenèse choroïde pathologique, une caractéristique saillante de la dégénérescence maculaire relative à l’âge, mène à l’affaiblissement de vision et à la cécité. Les tests de prolifération des cellules endothéliales (EC) utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs) ou des EC rétiniennes primaires isolées sont largement utilisés dans des modèles in vitro pour étudier l’angiogenèse rétinienne. Cependant, isoler les cellules endothéliales rétiniennes murines pures est techniquement difficile et les CE rétiniens peuvent avoir des réponses de prolifération différentes que les cellules endothéliales choroïdes et les différentes interactions cellule/cellule. Un essai choroïdien choroïde fortement reproductible de germination comme modèle de prolifération microvasculaire choroïde a été développé. Ce modèle inclut l’interaction entre la vascularisation choroïde (EC, macrophages, péricytes) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les explants rpe/choroïdes/scléraux de souris sont isolés et incubés dans l’extrait basal de membrane croissance-facteur-réduit (BME) (jour 0). Le milieu est changé tous les deux jours et la germination choroïde est quantifiée au jour 6. Les images de l’explantation choroïde individuelle sont prises avec un microscope de phase inversée et la zone de germination est quantifiée à l’aide d’un plug-in macro semi-automatisé au logiciel ImageJ développé dans ce laboratoire. Cet essai reproductible de germination choroïde ex vivo peut être employé pour évaluer des composés pour le traitement potentiel et pour la recherche microvasculaire de maladie pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération choroïde de micro navire utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.

La dysrégulation choroïde d’angiogenèse est associée à la dégénérescence maculaire relative à l’âge néoovasculaire (DME)¹. Le choroïde est un lit microvasculaire présent sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Il a été démontré que la réduction du flux sanguin dans le choroïde est associée à la progression de la D AMD². La relation complexe entre l’endothélium vasculaire, l’EPR, les macrophages, les péricytes et d’autres cellules est responsable de l’homéostasie^{du tissu 3,4,5}. Par conséquent, un microenvironnement choroïdi....

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital (numéro de protocole ARCH 19-04-3913R).

1. Préparation

1. Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (10000 U/mL) et 5 mL et 10 mL de suppléments disponibles dans le commerce à 500 mL de milieu classique complet avec sérum. Aliquot 50 mL du milieu initialement.
   REMARQUE : Ne retournez aucun milieu au stock p.......

Comparaison de la croissance de la germination choroïde par jour

Nous avons disséqué le choroïde avec de la sclérienne, incrusté dans le BME et les avons cultivés pendant 6 jours( Figure 1). La germination choroïde chez les souris C57BL/6J du jour 3 au jour 6 a été examinée au microscope et quantifiée avec SWIFT-Choroid une méthode de quantification semi-automatisée dans ImageJ. Dans un cas représentatif, la zone choroïde de germin.......

L’analyse choroïdienne de germination aide la recherche dans amd néovasculaire^{9,10,18,19,20}. Les explantations choroïdes peuvent être isolées de souris ainsi que de rats et^{d’humains 17,21}. L’explant choroïde comprend les CE, les macrophages et les péricytes¹⁷. Dans .......

Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), du Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, de la Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, du BCH Pilot Award, de la BCH Manton Center Fellowship et de la Little Giraffe Foundation (ZF), de la German Research Foundation (DFG; à BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH CRDI (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).