JoVE Logo
Faculty Resource Center
Authors
Librarians
High Schools
About

Sign In

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Acknowledgements

Materials

References

Biology

אקס ויוו צ'רויד נבט א-סאי של אנגיוגנזה מיקרו-וסקולרית עינית

Published: August 6th, 2020

DOI:

10.3791/61677

1Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, 2Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, 3Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

פרוטוקול זה מציג בדיקה נבטי choroid, מודל vivo לשעבר של התפשטות מיקרוווסקולרית. בדיקה זו יכולה לשמש כדי להעריך מסלולים המעורבים בהתרבות כלי מיקרו choroidal ולהעריך טיפולים תרופתיים באמצעות סוג פראי רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

אנגיוגנזה פתולוגית choroidal, תכונה בולטת של ניוון מקולרי הקשור לגיל, מוביל ליקוי ראייה ועיוורון. בדיקות התפשטות תאי אנדותל (EC) באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) או ECs רשתית ראשונית מבודדת נמצאים בשימוש נרחב במודלים במבחנה לחקר אנגיוגנזה ברשתית. עם זאת, בידוד טהור מורין תאי אנדותל רשתית הוא מאתגר מבחינה טכנית ECs רשתית עשוי להיות תגובות התפשטות שונות מאשר תאי אנדותל choroidal ואינטראקציות תאים / תאים שונים. מאוד לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים בדיקה כמודל של התפשטות כלי דם microvascular choroidal פותחה. מודל זה כולל את האינטראקציה בין כלי דם choroid (EC, מקרופאגים, pericytes) ו אפיתל פיגמנט רשתית (RPE). עכבר RPE/ choroid / מתפוצצים scleral מבודדים דגירה תמצית קרום בסיס מופחת גורם גדילה (BME) (יום 0). מדיום משתנה כל יומיים ונבט choroid הוא כימת ביום 6. התמונות של explant choroid בודדים נלקחים עם מיקרוסקופ פאזה הפוך ואת האזור נבט הוא לכמת באמצעות תוסף מאקרו אוטומטי למחצה לתוכנת ImageJ שפותחה במעבדה זו. בדיקה זו להתרבות לשכפל לשעבר vivo choroidal נבטים ניתן להשתמש כדי להעריך תרכובות לטיפול פוטנציאלי עבור מחקר מחלות מיקרוווסקולריות כדי להעריך מסלולים המעורבים התפשטות כלי מיקרו choroidal באמצעות סוג הבר רקמת עכבר מהונדסים גנטית.

Dysregulation אנגיוגנזה Choroidal קשורה ניוון מקולרי הקשורות לגיל neovascular (AMD)1. הצ'רואיד היא מיטה מיקרוווסקולרית מתחת לאפיתל הפיגמנט הרשתית (RPE). הוכח כי זרימת דם מופחתת choroid קשורה להתקדמות של AMD2. הקשר המורכב בין אנדותל כלי דם, RPE, מקרופאגים, קרום הלב ותאים אחרים אחראי על הונוסטזיסשל הרקמה 3,4,5. לכן, בדיקה לשחזור מידול microenvironment choroidal הוא קריטי לחקר AMD neovascular.

Ex vivo angiogenesis בדיקות ותרבויות תאים אנדותל במבחנה יכול להשלים מחקרים של התנהגות microvascular ב vivo, לבדי....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כל הניסויים בבעלי חיים שתוארו אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים מוסדיים בבית החולים לילדים בבוסטון (פרוטוקול ARCH מספר 19-04-3913R).

1. הכנה

  1. הוסף 5 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (10000 U / mL) ו 5 מ"ל ו 10 מ"ל של תוספי מזון זמינים מסחרית ל 500 מ"ל של מדיום קלאסי מלא עם סרום. Aliquot 50 מ"?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

השוואה של צמיחה נביעה choroid ליום

ניתרנו את הצ'רויד עם סקלרה, מוטבע ב-BME ותרבתנו אותם במשך 6 ימים(איור 1). נביעה choroid בעכברים C57BL/6J מיום 3 ליום 6 נבדקו עם מיקרוסקופ וכמתו עם SWIFT-Choroid שיטת כימות אוטומטית למחצה ImageJ. במקרה מייצג, שטח הנביטה של הכורואידל (כלי השיט .......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המדגמה הנבטת choroidal מסייעת למחקר ב AMD neovascular9,10,18,19,20. מתפוצצים Choroid ניתן לבודד מעכברים, כמו גם חולדות ובני אדם17,21. explant choroid כולל ECs, מקרופאגים, ו pericytes17. בהבחנה ?.......

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

העבודה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הסוכרתית Manpei סוזוקי (YT), בית החולים לילדים בבוסטון OFD / BTREC / CTREC הפקולטה לפיתוח קריירה מענק, בוסטון ילדים בית החולים Ophthalmology הקרן, BCH פיילוט פרס, BCH מנטון מרכז מלגות, וקרן ג'ירפה הקטנה (ZF), קרן המחקר הגרמנית (DFG; לפנה"ס [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY017-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), קרן עין האריות של מסצ'וסטס (LEHS).

....

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NameCompanyCatalog NumberComments
AnaSed (Xylazine)AKORN59339-110-20
Basal membrane extract (BME) MatrigelBD Biosciences354230
Cell culture dishNEST70400110cm
Complete classic medium with serum and CultureBoostCell systems4Z0-500
Ethyl alcohol 200 ProofPharmco111000200use for 70%
KimwipesKimberly-Clark06-666
MicroscopeZEISSAxio Observer Z1
Penicillin/StreptomycinGIBCO1514010000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)Olympus25-107
VetaKet CIII (Ketamine)AKORN59399-114-10

  1. Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
  2. Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
  3. Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
  4. Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473 (2019).
  5. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  6. Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
  7. Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
  8. Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
  9. Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
  10. Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
  11. Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
  12. Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564 (2009).
  13. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
  14. Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
  15. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  16. Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
  17. Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
  18. Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
  19. Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
  20. Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
  21. Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
  22. Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
  23. Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
  24. Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
  25. Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
  26. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
  27. Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved