ऑक्यूलर माइक्रोवैस्कुलर एंजियोजेनेसिस का एक पूर्व वीवो कोरॉइड स्प्राउटिंग परख

Published: August 6th, 2020

DOI:

10.3791/61677

Yohei Tomita¹, Zhuo Shao², Bertan Cakir¹, Yumi Kotoda¹, Zhongjie Fu^1,3, Lois E.H. Smith¹

¹Department of Ophthalmology, Boston Children's Hospital, Harvard Medical School, ²Department of Clinical and Metabolic Genetics, Hospital for Sick Children, University of Toronto, ³Manton Center for Orphan Disease, Harvard Medical School, Boston Children's Hospital

यह प्रोटोकॉल कोरॉयड अंकुरण परख प्रस्तुत करता है, जो माइक्रोवैस्कुलर प्रसार का एक पूर्व वीवो मॉडल है। इस परख का उपयोग कोरोइडल माइक्रो जहाजों के प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने और जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके दवा उपचार का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

पैथोलॉजिकल कोरॉयड एंजियोजेनेसिस, उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन की एक प्रमुख विशेषता, दृष्टि हानि और अंधापन की ओर जाता है। एंडोथेलियल सेल (ईसी) प्रसार परिध मानव रेटिना माइक्रोवैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचआरएमईसी) या अलग प्राथमिक रेटिना ईसी का उपयोग रेटिना एंजियोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए विट्रो मॉडल में व्यापक रूप से किया जाता है। हालांकि, शुद्ध मुरीन रेटिना एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करना तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और रेटिना एसी में कोरॉयड एंडोथेलियल कोशिकाओं और विभिन्न सेल/सेल इंटरैक्शन की तुलना में अलग-अलग प्रसार प्रतिक्रियाएं हो सकती हैं। कोरोइडल माइक्रोवैस्कुलर प्रसार के मॉडल के रूप में एक अत्यधिक प्रजनन योग्य पूर्व वीवो कोरो कोरॉइडल अंकुरण परख विकसित की गई थी। इस मॉडल में कोरॉइड वैक्यूलेचर (ईसी, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स) और रेटिना पिगमेंट एपिथेलियम (आरपीई) के बीच बातचीत शामिल है। माउस आरपीई/कोरॉयड/स्क्लेरल एक्सप्लांट्स को विकास-कारक-कम बेसल झिल्ली निकालने (बीएमई) (दिन 0) में अलग-थलग और इनक्यूबेटेड किया जाता है । मध्यम हर दूसरे दिन बदल जाता है और 6 दिन में कोरॉइड अंकुरण की मात्रा निर्धारित की जाती है। व्यक्तिगत कोरॉइड एक्सप्लांट की छवियों को एक उल्टे चरण माइक्रोस्कोप के साथ लिया जाता है और अंकुरण क्षेत्र को इस प्रयोगशाला में विकसित इमेजजे सॉफ्टवेयर में अर्ध-स्वचालित मैक्रो प्लग-इन का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जाता है। इस प्रजनन पूर्व वीवो कोरोइडल अंकुरण परख का उपयोग संभावित उपचार के लिए यौगिकों का आकलन करने और सूक्ष्मवहन रोग अनुसंधान के लिए जंगली प्रकार और आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस ऊतक का उपयोग करके कोरॉयडल माइक्रो पोत प्रसार में शामिल रास्तों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

कोरॉइडल एंजियोजेनेसिस डिस्रेगुलेशन नियोवैस्कुलर उम्र से संबंधित मैकुलर डिजनरेशन (एएमडी)¹से जुड़ा हुआ है। कोरॉयड रेटिना वर्णक एपिथेलियम (आरपीई) के नीचे मौजूद एक माइक्रोवैस्कुलर बिस्तर है। यह दर्शाया गया है कि कोरॉइड में रक्त प्रवाह में कमी एएमडी²की प्रगति से जुड़ी हुई है . संवहनी एंडोथेलियम, आरपीई, मैक्रोफेज, पेरिसाइट्स और अन्य कोशिकाओं के बीच जटिल संबंधऊतक^3,^4,⁵के होमोसेस्टेसिस के लिए जिम्मेदार है। इसलिए, नेओवैस्कुलर एएमडी के अध्ययन के लिए एक प्रजनन योग्य परख मॉडलिंग कोरोइडल माइक्रोएनवायरमेंट महत्वपूर्ण है।

वर्णित सभी पशु प्रयोगों बोस्टन बच्चों के अस्पताल में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया (ARCH प्रोटोकॉल संख्या 19-04-3913R) ।

1. तैयारी

पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (10000 यू/ए?.......

प्रति दिन कोरॉइड अंकुरण वृद्धि की तुलना

हमने बीएमई में एम्बेडेड स्क्लेरा के साथ कोरॉइड को विच्छेदित किया और उन्हें 6 दिनों(चित्रा 1)के लिए सुसंस्कृत किया। 3 से 6 दिन तक C57BL/6J चूह.......

कोरोइडल अंकुरित परख से नियोवैस्कुलर एएमडी 9 ,¹⁰^,¹⁸,¹⁹^,²⁰में शोध होता है . कोरॉयड एक्सप्लांट को चूहों के साथ - साथ चूहों और मनुष्यों से अलग किया जा स?.......

इस काम को मैनपेई सुजुकी डायबिटिक फाउंडेशन (वाईटी), बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ओएफडी/बीआरईआरसी/सीटीआरईसी फैकल्टी करियर डेवलपमेंट ग्रांट, बोस्टन चिल्ड्रन हॉस्पिटल ऑप्थेलमोलॉजी फाउंडेशन, बीसीएच पायलट अवार्ड, बीसीएच मैन्टन सेंटर फेलोशिप और लिटिल जिराफ फाउंडेशन (जेडएफ), जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । बीसी के लिए [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, बीसीएच IDDRC (1U54HD090255), मैसाचुसेट्स लायंस आई फाउंडेशन (LEHS) ।

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Name	Company	Catalog Number	Comments
AnaSed (Xylazine)	AKORN	59339-110-20
Basal membrane extract (BME) Matrigel	BD Biosciences	354230
Cell culture dish	NEST	704001	10cm
Complete classic medium with serum and CultureBoost	Cell systems	4Z0-500
Ethyl alcohol 200 Proof	Pharmco	111000200	use for 70%
Kimwipes	Kimberly-Clark	06-666
Microscope	ZEISS	Axio Observer Z1
Penicillin/Streptomycin	GIBCO	15140	10000 U/mL
Tissue culture plate (24-well)	Olympus	25-107
VetaKet CIII (Ketamine)	AKORN	59399-114-10

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