En ex vivo choroid spirende analyse av okulær mikrovaskulær angiogenese

Denne protokollen presenterer choroid spirende analyse, en ex vivo modell av mikrovaskulær spredning. Denne analysen kan brukes til å vurdere veier involvert i å spre koroide mikrokar og vurdere medikamentell behandling ved hjelp av vill type og genmodifisert musevev.

Patologisk choroidal angiogenese, et fremtredende trekk ved aldersrelatert makuladegenerasjon, fører til synshemming og blindhet. Endotelcelle (EC) spredningsanalyser ved hjelp av humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMECer) eller isolerte primære retinale ECer er mye brukt in vitro-modeller for å studere retinal angiogenese. Imidlertid er det teknisk utfordrende å isolere rene murine retinale endotelceller, og retinale ECer kan ha forskjellige spredningsresponser enn koroidale endotelceller og forskjellige celle/celleinteraksjoner. En svært reproduserbar ex vivo choroidal spirende analyse som en modell av choroidal mikrovaskulær spredning ble utviklet. Denne modellen inkluderer samspillet mellom choroid vaskulatur (EC, makrofager, pericytter) og retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants er isolert og inkubert i vekstfaktorredusert basalmembranekstrakt (BME) (dag 0). Medium endres annenhver dag og choroid spirende er kvantifisert på dag 6. Bildene av individuelle choroid explant er tatt med en invertert fase mikroskop og spireområdet kvantifiseres ved hjelp av en semi-automatisert makro plug-in til ImageJ programvare utviklet i dette laboratoriet. Denne reproduserbare ex vivo choroidal spirende analysen kan brukes til å vurdere forbindelser for potensiell behandling og for mikrovaskulær sykdom forskning for å vurdere veier involvert i choroidal mikro fartøy spredning ved hjelp av vill type og genmodifisert musvev.

Choroidal angiogenese dysregulering er forbundet med neovaskulær aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD)¹. Choroid er en mikrovaskulær seng tilstede under retinal pigment epitel (RPE). Det har vist seg at redusert blodstrøm i choroid er forbundet med progresjon av AMD². Det intrikate forholdet mellom vaskulær endotel, RPE, makrofager, pericytter og andre celler er ansvarlig for homeostase av^{vevet 3,4,5}. Derfor er en reproduserbar analyse modellering koroid mikromiljø kritisk for studiet av neovaskulær AMD.

Alle dyreforsøk beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Boston Children's Hospital (ARCH protokollnummer 19-04-3913R).

1. Forberedelse

1. Tilsett 5 ml Penicillin/Streptomycin (10000 E/ml) og 5 ml og 10 ml kommersielt tilgjengelige kosttilskudd til 500 ml komplett klassisk medium med serum. Aliquot 50 ml av mediet i utgangspunktet.
   MERK: Ikke returner noe medium tilbake til lageret for å unngå kontaminering.
2. Legg en aliquot av komplett kl.......

Sammenligning av choroid spirende vekst per dag

Vi dissekerte choroid med sclera, innebygd i BME og kultivert dem i 6 dager (Figur 1). Choroidspirende i C57BL/6J-mus fra dag 3 til dag 6 ble undersøkt med et mikroskop og kvantifisert med SWIFT-Choroid en halvautomatisk kvantifiseringsmetode i ImageJ. I et representativt tilfelle var det koroide spireområdet (fartøyene som strekker seg fra skrå, unntatt selve utstrakte) 0,38 mm² på d.......

Den koroide spirende analysen hjelpemidler forskning i neovaskulær AMD^{9,10,18,19,20}. Choroid explants kan isoleres fra mus samt rotter og mennesker^17,21. Choroid explant inkluderer EC, makrofager og pericytes¹⁷. I denne analysen bidrar samspillet mellom koroide ECer og tilstøt.......

Arbeidet ble støttet av Grants fra Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship og Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; til BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).