En Ex Vivo Choroid Sprouting Assay av okulär Microvascular Angiogenesis

Detta protokoll presenterar koridider groning assay, en ex vivo modell av microvascular spridning. Denna analys kan användas för att bedöma vägar som deltar i proliferering choroidal mikrokärl och bedöma läkemedelsbehandlingar med hjälp av vild typ och genetiskt modifierade musvävnad.

Patologiska choroidal angiogenes, en framträdande egenskap hos åldersrelaterade makuladegeneration, leder till synnedsättning och blindhet. Endothelial cell (EG) spridningsanalyser med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) eller isolerade primära retinala ECS används i stor utsträckning in vitro-modeller för att studera retinal angiogenes. Isolera ren murin retinal endotel celler är emellertid tekniskt utmanande och retinal ECs kan ha olika spridning svar än choroidal endotel celler och olika cell/cell interaktioner. En mycket reproducerbara ex vivo choroidal sprouting assay som en modell av choroidal microvascular spridning utvecklades. Denna modell omfattar samspelet mellan choroid vasculature (EG, makrofager, pericyter) och retinal pigment epitel (RPE). Mus RPE/choroid/scleral explants isoleras och inkuberas i tillväxt-faktor-reducerade basalmembranextrakt (BME) (dag 0). Medium byts varannan dag och choroid groning kvantifieras vid dag 6. Bilderna av enskilda choroid explant tas med en inverterad fas mikroskop och groning området kvantifieras med hjälp av en halvautomatisk makro plug-in till ImageJ programvara som utvecklats i detta labb. Denna reproducerbara ex vivo choroidal sprouting assay kan användas för att bedöma föreningar för potentiell behandling och för mikrovaskulär sjukdom forskning för att bedöma vägar som deltar i koroidal mikrokärl spridning med hjälp av vild typ och genetiskt modifierade mus vävnad.

Choroidal angiogenes dysregulation är associerad med neovaskulära åldersrelaterade makuladegeneration (AMD)¹. Den choroid är en mikrovaskulär säng närvarande under den retinala pigment epitel (RPE). Det har visat sig att minskat blodflöde i choroid är associerad med progression av AMD². Det invecklade förhållandet mellan vaskulär endotelet, RPE, makrofager, pericyter och andra celler är ansvarig för vävnadens^{homeostas 3,4,5}. Därför är en reproducerbar analys modellering choroidal mikromiljö kritisk för studiet av neovaskulär AMD....

Alla djurförsök som beskrivs godkändes av institutionskommittén för djurvård och användning vid Boston Children's Hospital (ARCH-protokollnummer 19-04-3913R).

1. Förberedelse

1. Tillsätt 5 mL Penicillin/Streptomycin (10000 U/mL) och 5 mL och 10 mL av kommersiellt tillgängliga kosttillskott till 500 mL av komplett klassiskt medium med serum. Aliquot 50 mL av mediet initialt.
   OBS: Returnera inte något medium tillbaka till beståndet för att undvika kontaminering.
2. .......

Jämförelse av choroid spirande tillväxt per dag

Vi dissekerade choroid med sclera, inbäddade i BME och odlade dem i 6 dagar (Figur 1). Den choroid groning i C57BL/6J möss från dag 3 till dag 6 undersöktes med mikroskop och kvantifieras med SWIFT-Choroid en semi-automatiserad kvantifiering metod i ImageJ. I ett representativt ärende den choroidal groning område (de fartyg som sträcker sig från explant, exklusive själva explant) var 0,38.......

Den choroidal spirande analysen stöd forskning i neovaskulär AMD^{9,10,18,19,20}. Choroid explants kan isoleras från möss samt råttor och människor^17,21. Den choroid explant omfattar ECs, makrofager, och pericyter¹⁷. I denna analys samspelet mellan choroidal ECs och angränsa.......

Arbetet stöddes av Grants från Manpei Suzuki Diabettic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD / BTREC / CTREC Fakulteten Karriärutveckling Grant, Boston Children's Hospital Ofthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship, och Little Giraffe Foundation (ZF), Den tyska Forskningsstiftelsen (DFG; till BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY017-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).