עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהאקדמיה של פינלנד [315948, 314387 ל- N.K.]; קרן סיגריד ג'וסליוס [ל-נ.ק., ג'יי.טי]; קרן אמיל אלטונן [לג'יי-איי.M,ט.ל.]; תוכנית הדוקטורט של טורקו לרפואה מולקולרית [S.C.-M., O.O.].

תחזוקת עכברי מעבדה וכל הניסויים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה באוניברסיטת טורקו.
1. הכנת צינוריות חצי-היקפיות למיקרו-דיסקציה
<ol><li>להקריב עכבר זכר בוגר (≥8 שבועות, testis 80–120 מ"ג בהתאם למתח ולגיל) באמצעות CO2 חנק ואחריו נקע בצוואר הרחם. הערה: העכבר צריך להיות בוגר מינית, ועדיף לפחות 8 שבועות. דפוס transillumination של עכברים צעירים שונה ממבוגר כי הגל של אפיתל חצי-חצי עדיין לא הוקמה במלואה, ואת העיתוי של הגל הראשון של spermatogenesis הוא ברור21,22. חוסר זרע מאריך בעכברים זכרים בני 4 שבועות מונע את השימוש בהם למיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה. כל זני העכבר כי יש spermatogenesis נורמלי ניתן להשתמש.</li>
	<li>לרסס את הבטן הגחונית עם 70% אתנול. פתח את החלל abdominopelvic באמצעות מספריים סטריליים, מה שהופך פתח בצורת V.</li>
	<li>משיכת כרית השומן האפידילית עם מלקחיים סטריליים, לאתר את האשכים, לנתח אותם באמצעות מספריים ומניחים אותם על צלחת פטרי סטרילית 100 מ"מ המכיל PBS. הערה: כדי לשמור על סטריליות, ודא שכל כלי המעבדה והכלים הכירורגיים סטריליים.</li>
	<li>באמצעות מספריים עדינים לתמצת את האשכים על ידי חיתוך חריץ אלבוג'יניאה טוניקה, גיליון סיבי עבה עוטפת את האשכים. ואז לקרוע את tunica פתוח באמצעות זוג מלקחיים. כפה את הצינוריות על ידי לחיצה עם מלקחיים ולזרוק את tunica. הערה: בעת השלכת טוניקה, זה עשוי להיות מועיל עבור כמה יישומים במורד הזרם כי האשכים arteria מוסר יחד עם טוניקה. הימנע מפגיעה בצינורות החצי-חופניים.</li>
	<li>מעבירים את הצינוריות החצי-חצי לצלחת פטרי חדשה ויוצקים מספיק PBS סטרילי כדי לכסות את תחתית צלחת הפטרי. לאחר מכן, בעדינות למשוך את הצינוריות לגזרים אבל למנוע פגיעה tubules. הערה: לחץ מכני רב מדי יעכב את דפוס הטרנסילומינציה וישפיע על הכדאיות של הרקמה ועל הארכיטקטורה התאית שלה. הצינוריות יכולות גם להיות מעובדות עבור immunostainings הר שלם מנקודה זו ללא היערכות (3B). לפעמים זה מספיק כדי להגדיר את השלב בדיעבד על ידי הכללת נוגדנים נגד חלבונים לידי ביטוי בידול spermatogonia, כגון SALL4, c-KIT ו DNMT3A18,23. צפיפות הזרע היא מדד שלב אמין יחסית (איור 2).</li>
</ol>2. מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה
<ol><li>מניחים את צלחת פטרי תחת מיקרוסקופ ניתוח בחוזקה על ידי הקלטת אותו לבמה. הערה: חשוב להקליט היטב את צלחת פטרי כדי למנוע את התנועה שלה אשר יכול לגרום ערבוב של קטעי tubule מבוים למחצה שנאספו.</li>
	<li>כדי לחשוף את דפוס ספיגת האור של tubules חצי חצי בפוקוס, ודא כי המדגם מואר מלמטה ואת האור עובר דרך המדגם, כלומר, הוא transilluminated. הערה: כמות האור שנספגת/מפוזרת היא יחסית לרמת עיבוי הכרומטין בזרעים מאריכים והצרור שלהם בתוך הצינור החצי-חצי- צינורית: ככל שהתמצית יותר, כך האור נספג יותר, כלומר, נראה כהה יותר.</li>
	<li>הכירו את תבנית ספיגת האור של שלבים שונים כמתואר באיור 2, איור 5A ואיור S1 על ידי הזזה קפדנית של חבילות של צינוריות באמצעות מלקחיים עדינים. הערה: השלבים תמיד עוקבים זה אחר זה בסדר הגיוני, ויוצרים את גל האפיתל החצי-שנתי. עם זאת, חשוב לדעת כי הכיוון של הגל spermatogenic מדי פעם מתהפך ולאחר מכן חוזר שוב (הידוע גם בשם אפנונים4,9 ),לפעמיםמסבך את ההליך. כמו כן, אורך כל שלב, במונחים של כמה מ"מ של tubule, משתנה במידה ניכרת.</li>
	<li>בזהירות להרים את tubule של עניין באמצעות מלקחיים עם קצה מכור, ולאחר מכן לחתוך קטע של אורך מתאים באמצעות מספריים microdissection (ראה וידאו משלים 1). וו בקצה המלקחיים מקל על ההרמה וההחזקה של צינורית ומסייע במניעת סחיטה. הערה: אורך המקטעים שיש לחתוך תלוי ביישומים במורד הזרם. לאיסוף חתיכות טובולה במאגר של שלב מסוים לניתוח חלבון או רנ"א12,13 (II-V, VII-VIII ו- IX-XI, איור 5B) האורך הוא בדרך כלל 2-5 מ"מ. כאשר נעשה שימוש בהפקת פנול-כלורופורם סטנדרטית, ניתן להפיק כ-200 ng של RNA מ-1 מ"מ של טובול. עבור כתמי הרכבה שלמים של מקטעי tubule מבוימים, אורך המקטעים צריך להיות >5 מ"מ. עבור ההכנות סקווש אורך המקטעים לא יעלה על 1-2 מ"מ כי התאים באמצע הקטע עלול להיכשל לצאת אם ארוך מדי. השתמש בסולם מ"מ מתחת לצלחת פטרי למדידה מדויקת של אורך הצינור.</li>
</ol>3. חיסון של הכנות שונות
<ol><li>הכנת סקווש: אימות במה וחיסון הערה: חתיכות tubule ספציפי שלב ניתן למעוך על שקופית מיקרוסקופ עם זכוכית כיסוי לבצע ניתוח מורפולוגי של תאים חיים על ידי מיקרוסקופיה ניגוד פאזה ו immunostaining הבאים. למתחילים מומלץ להשתמש בגישה זו כדי לאמת את השלבים בעת היכרות עם שיטת microdissection בסיוע transillumination.<ol>
<li>לאסוף את הקטע בנפח של 10 μL באמצעות פיפטה ולהעביר אותו על שקופית מיקרוסקופ.</li>
		<li>למעוך את הצינורית על ידי הנחת כיסוי (20 ממ x 20 ממ) בזהירות על הצינור. כתוצאה מכך, תאים יזרמו החוצה את הצינור ויוצרים מונולאי תא חי. מניחים נייר סינון על קצה זכוכית הכיסוי כדי להקל על התפשטות התאים. הימנע ממועך את התאים יותר מדי כדי לשמור אותם בחיים.</li>
		<li>נטר את התפשטות התאים תחת מיקרוסקופ. השתמש במיקרוסקופ עם ניגודיות פאזה במטרה 40x כדי לאמת זיהוי שלב על-ידי בדיקת סוגי התאים הקיימים (איור 2, איור S2).</li>
		<li>לאחר שהתאים התפשטו כדי ליצור מונולייר עגול משני קצות הצינור, טובלים את המגלשה לתוך מיכל המכיל חנקן נוזלי תוך החזקתו במלקחיים. שמור אותו שקוע במשך 10 שניות. לחלופין, הניחו את המגלשה על צלחת קרח יבשה להקפאה.</li>
		<li>הסר את זכוכית הכיסוי על ידי היפוך אותו באמצעות אזמל.</li>
		<li>ללא דיחוי, המשיכו עם הקיבעון והניחו במהירות את השקופית במיכל עם 90% אתנול למשך 2-5 דקות. הערה: ודא הכנת סקווש לא להפשיר לפני הצבת אותו 90% אתנול. מתקנים אחרים יכולים לשמש גם, כגון אצטון, במשך 10 דקות.</li>
		<li>יבש באוויר ומאחסן בטמפרטורת החדר (RT) (עד כמה ימים) או ב -80 מעלות צלזיוס (לטווח ארוך).</li>
		<li>עבור immunostaining, לאחר לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 10 דקות ב RT.</li>
		<li>יש לשטוף ב-PBS ולחלחל עם 0.1% טריטון X-100 ב-PBS למשך 5 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף ב-PBS ולצייר טבעת גריז סביב כל דגימת סקווש.</li>
		<li>הוסף 50-100 μL של 10% BSA (אלבומין סרום שור) ב 0.1% Tween ב PBS (PBST) בתוך טבעת השומן ולחסום דגימות במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>הסר את פתרון BSA ודגר עם נוגדן ראשוני מדולל ב 10% BSA ב PBST עבור 1 שעה ב RT.</li>
		<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות עם PBST.</li>
		<li>דגירה עם נוגדן משני מדולל ב 10% BSA ב PBST. הערה: כדי להכתים את האקרוזומים, ניתן להדגיר את הדגימות בנוגדן אגלוטינין בוטנים (PNA, 1:1000) ב- 10% BSA ב- PBST למשך שעה אחת ב- RT (איור S3) במקום נוגדנים ראשוניים ומשניים ספציפיים.</li>
		<li>לשטוף 3x במשך 5 דקות כל אחד עם PBST, לשטוף עם PBS ולהרכיב עם תושב המכיל DAPI.</li>
	</ol></li>
	<li>חיסון בהר שלם של צינוריות חצי-חופפות הערה: הפרוטוקול שלהלן מתאר כתמי הרכבה שלמים עבור מקטעי צינורית בשלבים (משלב 2.4). אם חוקר רוצה לבצע צביעה שלמה ללא אחסון זמני (משלב 1.5), שים לב להערות ב- 3.2.1 ו- 3.2.7.<ol>
<li>באמצעות פיפטה, להעביר את מקטעי tubule (משלב 2.4) ב PBS קר כקרח לתוך צינור חרוט 15 מ"ל ולאפשר להם משקעים על קרח. הערה: אם משתמשים בצינורות לא מתויגים מ-1.5, מפרידים את הצינוריות בצלחת פטרי על ידי צנרת למעלה ובחזרה לצלחת מוטה מספר פעמים. השתמש פיפטה 1-mL עם קצה לחתוך. שלב זה נועד לפתוח את מבנה הרקמה. עם זאת, הימנע צינור יותר מדי כפי שהוא עלול לגרום נזק tubules. משקעים של צינוריות ייקח כמה עשרות שניות. שברי צינורית קטנים, תאים ביניים ופסולת תאים נשארים בסופרנאטנט.</li>
		<li>הסר בזהירות את supernatant (SN) על ידי pipetting או עם שאיפה. מוסיפים 10 מ"ל של PBS קר כקרח ומערבבים על ידי היפוך.</li>
		<li>אפשר משקעים ולאחר מכן הסר SN כמו קודם.</li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של 4% PFA ותקן במשך 5 שעות על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: זמן הקיבעון תלוי בחלבונים המעניינים ובלוקליזציה התת-תאית שלהם. עבור חלבונים גרעיניים ציטופלזמיים, קיבוע 2 שעות הוא בדרך כלל מספיק, עם זאת, סמני קרום, כגון GFRα1 (אלפא קולטן משפחת GDNF 1; איור 6א',ב),תיהנה מקיבעון ארוך יותר, עד 6 שעות.</li>
		<li>אפשר משקעים, להסיר SN (PFA) כמו קודם, ולשטוף בקצרה על ידי הוספת 10 מ"ל של PBS והפך את הצינור.</li>
		<li>אפשר משקעים, להסיר SN כמו קודם, ולחזור על שלב שטיפת PBS שלוש פעמים לפחות 10 דקות כל אחד על שולחן מסתובב ב +4 מעלות צלזיוס ולהמשיך עם כתמים או לאחסן ב +4 מעלות צלזיוס. הערה: אם תנאי העבודה סטריליים ולנקות את הדגימות ניתן לאחסן ולהשתמש בהם לפחות כמה שבועות. לחלופין, הוסיפו נתרן אזיד לריכוז סופי של 0.02% (w/v) מתמיסת 2% למניה כדי לסייע בשימור הצינוריות לפני האחסון ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, העבר מקטעי צינורית קבועים של 10-20 לצינור עגול של 2 מ"ל. אפשר משקעים ולהסיר SN. הערה: אם עובדים עם צינוריות ארוכות שלא בוימו, יוצקים את הצינוריות על צלחת פטרי ומשתמשים במספריים זעירים ומלקחיים חותכים מקטעים של כ-5-20 מ"מ. מקטעים ארוכים מדי יסתבכו במהלך הליך הכתם, ואילו מקטעים קצרים מדי יאבדו בקלות.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של 2% BSA + 10% FBS (סרום שור עוברי) ב 0.3% טריטון X-100 ב PBS (PBSX). חסום למשך שעה אחת לפחות בטבלה מסתובבת (20-30 סל"ד) ב- RT.</li>
		<li>לשטוף עם 1 מ"ל של PBSX, להסיר SN על ידי pipetting ולהוסיף 250 μL של נוגדן ראשוני מדולל 1% BSA ב PBSX (1:100-1:2000 דילול). דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב +4 מעלות צלזיוס על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד).</li>
		<li>הסר את פתרון הנוגדנים על ידי pipetting ולשטוף את tubules עם 1 מ"ל של PBSX כאמור לעיל. יש לשטוף שלוש פעמים ב-PBSX על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב-RT. הערה: לאחר שטיפה ראשונה זו ניתן להשאיר את הדגימה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס במידת הצורך.</li>
		<li>הסר SN ולהוסיף 250 μL של נוגדן משני מדולל 1% BSA ב PBSX (בדרך כלל 1:500 דילול של נוגדן תווית פלואורסצנטית). מכסים בנייר כסף ומדגירה על שולחן מסתובב (20-30 סל"ד) ב-RT למשך שעה.</li>
		<li>חזור על 3.2.10.</li>
		<li>לבסוף להסיר SN ויוצקים את tubules למגלשת מיקרוסקופ. יש להפריד בעדינות ולסדר צינוריות ברצועות ליניאריות בעזרת טיפים להעמסת ג'ל. מסננים את המאגר העודף ומוסיפים מדיום הרכבה וכיסוי. הערה: הימנע ייבוש של tubules בעת סידור אותם. מכתים נגד של הגרעינים עם DAPI אינו הכרחי ברוב המקרים. לאטום את קצה הכיסוי עם לק כדי למנוע ייבוש מדגם והידרדרות. ניתן לאחסן שקופיות למשך שבוע עד שבועיים ב- +4 °C (60 °F) לפני ההדמיה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology:+Seminiferous+Cycle.">Testis Physiology: Seminiferous Cycle.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Oakberg, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duration+of+spermatogenesis+in+the+mouse+and+timing+of+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium.">Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium.</a> The American Journal of Anatomy. 99 (3), 507-516 (1956).</li><li>Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+spermatogenesis+in+mammals:+seminiferous+epithelium+cycle+and+spermatogonial+renewal.">Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal.</a> Physiological Reviews. 52 (1), 198-236 (1972).</li><li>Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+wave+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">The wave of the seminiferous epithelium in the rat.</a> American Journal of Anatomy. 108 (1), 47-77 (1961).</li><li>de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., Fran&#231;a, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+Physiology-Overview+and+Histology.">Testis Physiology-Overview and Histology.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Leblond, C. P., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Definition+of+the+stages+of+the+cycle+of+the+seminiferous+epithelium+in+the+rat.">Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 55 (4), 548-573 (1952).</li><li>Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+seminiferous+epithelium.">Regulation of the seminiferous epithelium.</a> Endocrine Reviews. 3 (4), 404-417 (1982).</li><li>Kotaja, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation,+isolation+and+characterization+of+stage-specific+spermatogenic+cells+for+cellular+and+molecular+analysis.">Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis.</a> Nature Methods. 1 (3), 249-254 (2004).</li><li>Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+analysis+of+seminiferous+tubules+and+spermatogenic+waves+in+mice.">Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice.</a> Reproduction. 154 (5), 569-579 (2017).</li><li>Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histological and histopathological evaluation of the testis. , (1990).</li><li>Parvinen, M., Hecht, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+living+spermatogenic+cells+of+the+mouse+by+transillumination-phase+contrast+microscopic+technique+for+"in+situ"+analyses+of+DNA+polymerase+activities.">Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities.</a> Histochemistry. 71 (4), 567-579 (1981).</li><li>Ventel&#228;, S., M&#228;kel&#228;, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+regulation+of+a+stage-specific+stem+cell+niche+enriched+by+Nanog-positive+spermatogonial+stem+cells+in+the+mouse+testis.">Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis.</a> Stem Cells. 30 (5), 1008-1020 (2012).</li><li>Faisal, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+USF1+is+required+for+maintenance+of+germline+stem+cells+in+male+mice.">Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice.</a> Endocrinology. 160 (5), 1119-1136 (2019).</li><li>Wright, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stage-specific+proteins+synthesized+by+rat+seminiferous+tubules.">Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules.</a> Biology of Reproduction. 29 (1), 257-270 (1983).</li><li>Johnston, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage-specific+gene+expression+is+a+fundamental+characteristic+of+rat+spermatogenic+cells+and+Sertoli+cells.">Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8315-8320 (2008).</li><li>Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+flow+cytometric+analysis+of+mouse+seminiferous+epithelium.">DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium.</a> Cytometry. 9 (5), 456-462 (1988).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+signalling+promotes+germ+cell+survival+in+the+rat+testis.">Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis.</a> Reproduction. 142 (5), 711-721 (2011).</li><li>La, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+dynamic+undifferentiated+cell+states+within+the+male+germline.">Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline.</a> Nature Communications. 9 (1), 04827 (2018).</li><li>Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+rat+seminiferous+tubular+segments+from+defined+stages+of+the+epithelial+cycle+morphologic+and+immunolocalization+analysis.">In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis.</a> Journal of Andrology. 6 (6), 334-343 (1985).</li><li>Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+enzyme+quantitation+of+the+stages+of+the+seminiferous+epithelial+wave+in+the+rat.">Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat.</a> The Anatomical Record. 174 (4), 435-449 (1972).</li><li>Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis+in+the+immature+mouse+proceeds+faster+than+in+the+adult.">Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult.</a> International Journal of Andrology. 5 (3), 282-294 (1982).</li><li>Yoshida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+first+round+of+mouse+spermatogenesis+is+a+distinctive+program+that+lacks+the+self-renewing+spermatogonia+stage.">The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage.</a> Development. 133 (8), 1495-1505 (2006).</li><li>Chan, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+stem+cell+activity+is+sustained+by+SALL4-dependent+silencing+of+distinct+tumor+suppressor+genes.">Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes.</a> Stem Cell Reports. 9 (3), 956-971 (2017).</li><li>Lokka, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+localization+and+functions+of+macrophages+during+the+development+of+testis.">Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis.</a> Nat Commun. 11 (1), 4375 (2020).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testis+physiology:+Spermatogenic+cell+syncytium.">Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium.</a> Encyclopedia of Reproduction. , (2018).</li><li>Griswold, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis:+The+commitment+to+meiosis.">Spermatogenesis: The commitment to meiosis.</a> Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).</li><li>M&#228;kel&#228;, J. A., Toppari, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spermatogenesis.">Spermatogenesis.</a> Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. , 1-39 (2017).</li><li>Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+organelle+traffic+through+cytoplasmic+bridges+in+early+spermatids+of+the+rat:+mechanisms+of+haploid+gene+product+sharing.">Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing.</a> Molecular Biology of the Cell. 14 (7), 2768-2780 (2003).</li><li>Parvinen, M., Parvinen, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+movements+of+the+chromatoid+body.+A+possible+transport+mechanism+for+haploid+gene+products.">Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products.</a> The Journal of Cell Biology. 80 (3), 621-628 (1979).</li><li>Parvinen, M., S&#246;derstr&#246;m, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+rotation+and+formation+of+synapsis.">Chromosome rotation and formation of synapsis.</a> Nature. 260 (5551), 534-535 (1976).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

שיטת microdissection בסיוע transillumination שתיארנו לעיל מאפשרת גישה מוכוונת שלב לחקר זרע. Spermatogenesis הוא תהליך מסונכרן מאוד, וכל הצעדים העיקריים במהלך הבידול spermatogenic מוסדרים ומבוצעים באופן תלוי שלב, כגון מחויבות בידול (בשלבים VII-VIII), הופעת מיוזיס (VII-VIII), חטיבות מיוטיות (XII), הופעת התארכות זרע (VIII) ו זרע (VIII)1,26,27. הניתוח מונחה הבמה מספק כלי רב עוצמה ללמוד אירועים מסוימים אלה המוגבלים לשלבים ספציפיים של spermatogenesis ולכן נמצא רק בשלבים מוגדרים של מחזור האפיתל חצי. מאסטרינג השיטה לוקח קצת תרגול ושימוש במיקרוסקופ ניתוח באיכות טובה ותנאי תאורה נאותים הם המפתח להצלחה. יישום שיטה זו כחלק ערכת הכלים היומיומית יש יכולת לשפר באופן משמעותי את ההשפעה ואת הרלוונטיות הביולוגית של מחקר על תפקודי הרבייה הגברית על ידי מתן ניתוח מדויק יותר של אירועים מולקולריים במהלך spermatogenesis.
כל זני העכבר WT שלמדנו מציגים תבנית טרנסילומינציה דומה ומציגים אסוציאציות תאים שמורות בשלבים של מחזור האפיתל החצי-שנתי. בתנאי כי בידול spermiogenic של תאי נבט אינו שונה באופן גס מעכברי WT, אותו הדבר חל גם על כל המודלים בעכבר נוקאאוט כי למדנו. יתר על כן, זה יכול להיות מיושם על מינים אחרים המציגים סידור סגמנטי אורך של שלבים של מחזור אפיתל למחצה7. עם זאת, לא ניתן להשתמש במינים עם שלבים לא סגמנטיים (כגון בני אדם). בהתחשב בתפקיד המהותי של עיבוי כרומטין בהארכת זרע בהגדרת דפוס הטרנסילומינציה, ברור כי כל רגולציה שגויה של תהליך זה בהכרח תעכב את יישום שיטה זו. בעכברים צעירים ומבוגרים צעירים (5-6 שבועות) דפוס transillumination עדיין לא הוקמה במלואה, ולכן, רק עכברים מעל 8 שבועות יש להשתמש. חשוב גם לזכור כי סחיטה ומשיכת הצינוריות בהכרח לפגוע בדפוס transillumination כי זה מעוות את הארכיטקטורה התאית בתוך האפיתל חצי.
מקטעי השחפת המבודדים למחצה יכולים גם להיות תרבותיים המאפשרים התבוננות אקס ויוו ומניפולציה של תהליכים מצמד זרע, כולל מיוזיס. כדי להבטיח את הכדאיות של הרקמה ולמנוע השפלה RNA וחלבון, יש לאסוף את הדגימות ולעבד אותן לא יותר משעתיים לאחר הקרבת העכבר. עבור תרבות ex vivo של tubules חצי, הזמן מהקרבה לתחילת התרבות לא יעלה על 1 שעה. השלמות של שברי tubule בדרך כלל ניתן לשמור עד 72 שעות במבחנה אם נקצר כראוי.
השלב של מחזור האפיתל החצי-חצי יכול להיות מאומת ואף מוגדר בצורה מדויקת יותר באמצעות מיקרוסקופיית פאזה-ניגודיות של הכנות סקווש16. מיקרוסקופיה מבוצעת על תאים חיים, אשר מספק מימד נוסף לתוך הניתוח ומאפשר תצפית של organelle או תנועות תא בשלבים ספציפיים של spermatogenesis28,29,30. מיקרוסקופיית ניגודיות פאזה מספקת היערכות מדויקת לכשל חיסוני עוקב, המאפשר ניתוח מפורט מאוד של ביטוי החלבון ודינמיקת לוקליזציה במהלך spermatogenesis, כולל שינויים ספציפיים לשלב.
בעוד תאים משתחררים מההקשר האפיתל בהכנות סקווש, immunostainings הר שלם של מקטעי tubule לאפשר את המחקר של תאים spermatogenic בסביבה הפיזיולוגית שלהם. לכן, ההכנות להרכבה שלמה עשויות לספק הדמיה טובה יותר של ארכיטקטורת הצינור החצי-צינורית והמגעים הבין-תאיים שלה מאשר חיסון על חתכים. חשוב לציין, היערכות בסיוע transillumination של מקטעי tubule לפני immunostaining עושה את הגישה אפילו יותר חזק על ידי הכללת מידע על השלב הספציפי של קטע נתון. הכתמת הרכבה שלמה היא כלי שימושי במיוחד לחקר תאים בפריפריה של צינוריות חצי-צינוריות, כגון תאי מיואידים פריטובולריים, מקרופאגים פריטובולריים וזרעונים, אך עשויה גם לפתוח תובנות חדשניות על מחקר על תאי נבט מיוטיים ופוסט-מיוטיים.

בידול של תאי נבט זכר מ spermatogonia דיפלואידית כדי זרע haploid בוגרת, כלומר, spermatogenesis, הוא תהליך מורכב המתרחש באפיתל של צינוריות למחצה באשכים של אדם בוגר מינית1. צאצאים מיטוטיים של זרע A1 הראשון לחלק חמש פעמים כדי להרחיב את האוכלוסייה המחויבת לבידול, ואז להזין מיוזיס כמו זרע שבסופו של דבר להוליד זרע haploid. בידול של זרעונים עגולים לתוך זרע, כלומר, spermiogenesis, כרוך בשינויים מורכבים במורפולוגיה הסלולר, כולל דחיסה גרעינית ובניית מבנים ספציפיים לזרע כגון האקרוזום ואת הלקאה. בעכבר, כל התהליך של spermatogenesis לוקח 35 ימים כדי להשלים2,3.
בכל אזור נתון, האפיתל החצי-שנתי מארח עד חמש קבוצות של תאי נבט מבדילים בתוספת תאי גזע/אב נבט ותאי סרטולי סומטיים1. תאי נבט מבדילים יוצרים שכבות קונצנטריות שהרכבן צפוי, ותאי הפלואיד בשלב נתון של התפתחות תמיד מקשרים לסוגים מסוימים של זרעוניםוזרעונים 4,5. לכן, כל חתך רוחב של צינור מארח קבוצות של תאי נבט של הרכב קבוע. אסוציאציות תאים ספציפיות אלה מוגדרות כשבי האפיתל החצי-שנתי. שלבים כשלעצמם אינם מציגים מצבים דמויי נקודת צ'ק-פוינט עומדים, אך מתפתחים ללא הרף כאשר הבידול של קבוצות תאי הנבט מתקדם בסנכרון1,2,6. בעכברים, ישנם 12 שלבים (I-XII)2 המסודרים באופן מגזרי לאורך הציר האורך של הצינורית החצי-שנתית, והם עוקבים זה אחר זה בסדר הגיוני ובכך יוצרים את גל האפיתל החצי-שנתי, או גל זרע7,8,9 ( איור1). השלמת spermatogenesis לוקח ארבעה מחזורים, ושכבות היררכיות או קבוצות של תאים נבט הבחנה בתוך כל חתך צינור חצי צינורי הם מחזור חצי שנתי אחד בנפרד זה מזה. אורך המחזור תלוי במינים ובלעכבר כל מחזור לוקח 8.6 ימים10.
ניתן לזהות את השלבים על בסיס ההרכב התאי והארגון של האפיתל החצי-חצי-חצי-היסטולוגי בסעיפי האשכים ההיסטולוגיים5 (איור 1 ואיור 2). עם זאת, ניתוח היסטולוגי הוא מייגע, זמן רב ודורש תיקון וכתמים, ולכן לא יכול להיות מיושם על רקמה חיה. חשוב לציין, בימוי יכול להתבצע גם על רקמה חיה תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי ניצול דפוסי ספיגה/פיזור אור מובהקים המוצגים על ידי שלבים שונים של המחזור (איור 2). היכולת של כל שלב לספוג ולפזר אור היא יחסית לרמת עיבוי הכרומטין של זרעונים פוסט-מיוטיים מאוחרים שכל מארח שלב נתון ואריזת תאים אלה בחבילות7,11. בידול זרע, כלומר,spermiogenesis, מחולק עוד יותר 16 שלבים התפתחותיים, כולל 8 שלבים של זרע עגול (שלב 1-8) ו 8 שלבים של זרע מאריך (שלבים 9-16) בידול (איור 1). שלב 9-11 זרע מאריך (שלב IX-XI) להציג רק רמה נמוכה של עיבוי כרומטין וכתוצאה מכך כמות נמוכה של אור נספג. עיבוי כרומטין מתחיל בשלב 11 זרעונים (שלב XI), ובשלב 15-16 זרעונים מאריכים (שלב IV-VIII) מכילים כרומטין מרוכז במלואו, ולכן מפגינים ספיגת אור מקסימלית (איור 3). כרומטין צריך להיות מרוכז על מנת להיות ארוז בחוזקה לתוך ראש הזרע. גורמים נוספים התורמים לתבנית ספיגת האור הם מיקום של זרעונים מאריכים בתוך האפיתל (בסיסי לעומת אפיקלי) וחבילה של זרעונים מאריכים (מבוטא בשלבים II-V)11 (איור 3). חבילות נתפסות כנקודות באמצע הצינוריות ופסים בקצוות תחת מיקרוסקופ ניתוחי ככל שהכרומטין מרוכז יותר, כך הנקודה /פס11כהים יותר.
מאמר זה מתאר את השימוש בשיטת מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה לבידוד מקטעי צינורית חצי-היקפיים המייצגים שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי. לאחר בידוד, מקטעי tubule מבוימים יכולים להיות כפופים לניתוחים שונים במורד הזרם, כולל RNA ביוכימי וניתוחי חלבון12,13,14,15, cytometry זרימה16, לשעבר vivo tubule תרבות17 ו immunostaining18. כאן אנו מספקים גם פרוטוקולים מפורטים במורד הזרם כדי להכין מונוליירים מעוכים של מקטעי tubule מבוימים לניתוח מורפולוגי של תאים חיים ו immunostaining הבאים, כמו גם immunostainings הר שלם של מקטעי tubule. זרימת העבודה על קצה המזלג מתוארת באיור 4.
שיטת המיקרו-דיסקציה בסיוע transillumination מאפשרת זיהוי ובידוד מדויקים של תאי נבט בשלבים ספציפיים של בידול הודות להרכב התאי המסונכרן של השלבים. חשוב לציין, זה גם מאפשר את המחקר של אירועים תלויי במה במהלך spermatogenesis על רקמה חיה. בהתחשב בהיעדר מודלים מדרגיים במבחנה עבור spermatogenesis, שיטה זו יש גם יתרון ייחודי של מתן מחקרים התפתחותיים וטוקסיקולוגיים ממוקדים לטווח קצר על מקטעי צינורית ספציפיים לבמה ex vivo12,17. בעוד אנו מתארים את השיטה כאן עבור העכבר, אותו הליך יכול להיות מיושם על כל מין יונקים עם סידור אורך ומגזרי של שלבי אפיתל למחצה, כגון החולדה4,7,15,19,20.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cover glass 20x20 mm</td>
			<td>Menzel Gl&#228;ser</td>
			<td>11961988</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon conical tube 15-ml</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>grease pen (ImmEdge)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slide Superfrost Plus</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafolmaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (100-mm)</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11503387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>RL-1072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transillumination-assisted dissection of specific stages of the mouse seminiferous epithelial cycle for downstream immunostaining analyses

Spermatogenesis הוא תהליך בידול ייחודי שבסופו של דבר מעורר את אחד מסוגי התאים המובהקים ביותר של הגוף, הזרע. התמיינות של תאי נבט מתרחשת בכיסים הציטופלזמיים של תאי סרטולי סומטיים המארחים 4 עד 5 דורות של תאי נבט בו זמנית ומתאמים ומסנכרנים את התפתחותם. לכן, ההרכב של סוגי תאי נבט בתוך חתך הוא קבוע, ואסוציאציות תאים אלה ידועים גם בשם שלבים (I-XII) של מחזור האפיתל החצי-חצי. חשוב לציין, ניתן לזהות שלבים גם מצינורות חצי-חצי שלמים המבוססים על מאפייני ספיגת האור/פיזור הדיפרנציאליים שלהם שנחשפו על ידי טרנסילומינציה, והעובדה שהשלבים עוקבים זה אחר זה לאורך הצינור בסדר מספרי. מאמר זה מתאר שיטת מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה לבידוד מקטעי צינורית חצי-חצי-היקפיים המייצגים שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי של העכבר. תבנית ספיגת האור של צינוריות חצי-היקפיות נבדקת תחילה תחת מיקרוסקופ ניתוק, ולאחר מכן מקטעי צינורית המייצגים שלבים ספציפיים נחתכים ומשמשים ליישומים במורד הזרם. כאן אנו מתארים פרוטוקולים immunostaining עבור הכנות סקווש ספציפיות לשלב עבור מקטעי tubule שלמים. שיטה זו מאפשרת לחוקר להתמקד באירועים ביולוגיים המתרחשים בשלבים ספציפיים של spermatogenesis, ובכך לספק כלי ייחודי למחקרים התפתחותיים, טוקסיקולוגיים וציטולוגיים של זרע ומנגנונים מולקולריים בסיסיים.

Watch this Scientific Journal Video about Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses at JoVE.com

Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses

פרוטוקול זה מתאר מיקרו-דיסקציה בסיוע טרנסילומינציה של מקטעים של צינוריות עכבר בוגרות למחצה המייצגות שלבים ספציפיים של מחזור אפיתל חצי-היקפי, וסוגי תאים בו, וחיסון לאחר מכן של תכשירי סקווש ומקטעי צינור שלמים.

ניתוח בסיוע Transillumination של שלבים ספציפיים של מחזור האפיתל החצי-שנתי של העכבר לניתוחים Immunostaining במורד הזרם