Sammlung und Identifizierung von Pollen aus Honigbienenvölkern

Wir beschreiben Methoden zum Sammeln von Korbikularpollen von Honigbienen sowie Protokolle zur Farbsortierung, Acetolyse und Objektträgerpräparation von Pollen zur taxonomischen Identifizierung. Darüber hinaus präsentieren wir die Pelletfarbe und taxonomische Vielfalt von korbikulären Pollen, die aus fünf Anbausystemen mit Pollenfallen gesammelt wurden.

Forscher sammeln und analysieren häufig korbikuläre Pollen von Honigbienen, um die Pflanzenquellen zu identifizieren, auf denen sie nach Pollen suchen, oder um die Pestizidbelastung von Bienen über Pollen abzuschätzen. Hierin wird ein wirksames Pollenfangverfahren zum Sammeln von Korbikularpollen von Honigbienen beschrieben, die zu ihren Bienenstöcken zurückkehren. Diese Sammelmethode führt zu großen Mengen an Korbikularpollen, die für Forschungszwecke verwendet werden können. Honigbienen sammeln Pollen von vielen Pflanzenarten, besuchen aber normalerweise eine Art während jeder Sammelreise. Daher repräsentiert jedes korbikuläre Pollenpellet überwiegend eine Pflanzenart, und jedes Pollenpellet kann durch Farbe beschrieben werden. Dies ermöglicht die Sortierung von Proben von korbikulären Pollen nach Farbe, um Pflanzenquellen zu trennen. Forscher können korbikuläre Pollen weiter klassifizieren, indem sie die Morphologie von acetolysierten Pollenkörnern zur taxonomischen Identifizierung analysieren. Diese Methoden werden häufig in Studien verwendet, die sich auf Bestäuber beziehen, wie Bestäubungseffizienz, Bestäuber-Nahrungsdynamik, Ernährungsqualität und Vielfalt. Es werden detaillierte Methoden zum Sammeln von Korbikularpollen mit Pollenfallen, zum Sortieren von Pollen nach Farbe und zum Acetolysieren von Pollenkörnern vorgestellt. Ebenfalls vorgestellt werden Ergebnisse zur Häufigkeit von Pelletfarben und Taxa von Rabenpollen, die von Honigbienen in fünf verschiedenen Anbausystemen gesammelt wurden.

Die Westliche Honigbiene (Apis mellifera L.) ist ein wichtiger Bestäuber vieler landwirtschaftlicher Kulturen, die auf Bienenbestäubung angewiesen sind¹. Seit mehr als einem Jahrzehnt werden signifikante Verluste von Honigbienenvölkern gemeldet 2,3,4,5,6,7,8,9. Mehrere Faktoren - einschließlich Parasiten und Krankheiten, schlechte Ernährung und Pestizide - wurden mit dem Rückgang dieser Kolonien in Verbindung gebracht¹⁰. Schlechte Ernährung kann auf die landwirtschaftliche Intensivierung und den Verlust von Nahrungshabitat zurückgeführt^{werden 11}. Es ist unerlässlich, die Blumenressourcen zu verstehen, die von Bienen in verschiedenen Landschaften genutzt werden, um die Bienenernährung zu verbessern und die Bemühungen zum Schutz der Bienen zu unterstützen. Pollen ist die Hauptquelle für Proteine, Lipide, Vitamine und Mineralien für Bienen und wurde in vielen landwirtschaftlichen und ökologischen Studien verwendet, um die Präferenzen von Honigbienen auf Kolonieebene zu verstehen, die Auswirkungen des Pollenfangs auf Honigbienenvölker zu bewerten und die Pestizidbelastung gegenüber Bienen zu bestimmen^12,13,14.

Honigbienen sammeln Pollen von Blüten, verpacken Pollen in Pellets auf ihrer Corbicula - einem Tibiapollenkorb an ihrem Hinterbein - und kehren zur Lagerung in die Kolonie zurück. Korbikularpollen können von Sammlern entfernt werden, indem sie am Bienenstockeingang oder an Blüten gefangen, kurz gekühlt werden, um sie zu immobilisieren, und dann die Pollenpellets mit einer Pinzette von ihren Hinterbeinen entfernt werden. Der mühsame Prozess des manuellen Sammelns von Korbikularpollen von einzeln gefangenen Sammlern ist langsam und ineffizient, wenn man eine beträchtliche Menge an Pollen benötigt. Eine einfachere und effizientere Methode zum Sammeln großer Pollenmengen besteht darin, korbikuläre Pollenpellets von Honigbienen an Bienenstockeingängen einzufangen. Pollenfallen sind so konzipiert, dass sie korbikulare Pollen von den Beinen der zurückkehrenden Pollensammler entfernen, wenn sie in den Bienenstock^{gelangen 15}. Die Sammler müssen sich durch Maschenlöcher quetschen, die so dimensioniert sind, dass sie den Durchgang eines Honigbienenarbeiterkörpers ermöglichen.

Wenn die Honigbiene durch eines dieser Löcher geht, werden die größeren Pollenpellets von ihren Beinen abgekratzt und fallen in eine Auffangschale¹⁶. Studien haben gezeigt, dass Pollenfang Sammler dazu anregt, mehr Pollen zu sammeln, wodurch die Bestäubungseffizienz der umliegenden Pflanzen und Vegetation erhöht^{wird 17,18,19,20}. Pollensammelmethoden können auch verwendet werden, um das von Honigbienen in der Landschaft genutzte Futter als ersten Schritt zur Bestimmung der Quantität, Qualität und Taxa blühender Pflanzenarten zu verstehen. Effektive Pollenfangmethoden erleichtern somit sowohl die Bestäubung als auch die Ernährungsforschung von Honigbienen. Ein Vergleich dieser Pollensammelmethoden ist in Tabelle 1 dargestellt. Das Verhalten der Pollensuche ändert sich basierend auf dem Bedarf der Kolonie an gelagertem Pollen im Verhältnis zu ihren Ei- und Larvenpopulationen^21,22. Da diese Veränderungen unterschiedliche Sammelintensitäten beinhalten, ist oft eine hohe Variation der Pollenmenge zwischen Völkern am selben Standort und zwischen verschiedenen Standorten desselben Anbausystems oder Landschaftstyps zu erwarten^23,24. Die Erhöhung der Anzahl der Kolonien und Orte, an denen Pollen gefangen werden, wird dazu beitragen, diese Variation auszugleichen.

Pollenfallen variieren in der Effizienz^25,26. Die Größe der von Honigbienen gesammelten Pollenpellets variiert je nach Pflanzenart und kann sich je nach Höhe der Pollenspeicher in der Kolonie ändern^27,28. Dies birgt das Potenzial, dass kleinere Pollenpellets unterrepräsentiert und größere Pellets in Proben, die über Pollenfallen gesammelt werden, überrepräsentiert sind. Erwachsene Bienen variieren in der Körpergröße, was auch die Darstellung von Pollen beeinflussen kann, die in Fallen gesammelt werden. Es gibt auch Pflanzenarten, die überwiegend Nektar produzieren, der unentdeckt bleibt, wenn nur gesammelte Pollen in einigen Landschaften ausgewertet werden. Die Fangeffizienz wird auch durch die Abdrift und Desorientierung der Sammler beeinflusst, die vom Pollenfallentyp und dem Zustand der Bienenstockausrüstung beeinflusst wird. Dieses Problem kann durch den Einsatz der in diesem Dokument beschriebenen Techniken entschärft werden. Die Forscher können zusätzliche Forschungstechniken in Betracht ziehen, z. B. die Zählung von Blumenbesuchen durch Sammler, um die Ergebnisse der Präferenzen für die Nahrungssuche auf Kolonieebene zu ergänzen. Eine nützliche Methode zur Beurteilung der Pollenvielfalt ist die Sortierung von Korbikularpollen nach Farbe. Obwohl Honigbienen generalistische Sammler sind, zeigen sie auch Blütentreue, wo sie Pollen von derselben Pflanzenart am selben Ort während einer bestimmten Sammelreise sammeln. Aufgrund dieses Futtersuchverhaltens wird angenommen, dass jedes gegebene korbikuläre Pollenpellet überwiegend durch eine einzelne Pflanzenart repräsentiert wird 27,29,30,31. Daher können Wissenschaftler die Pollenvielfalt beschreiben, indem sie korbikuläre Pollen nach Pelletfarbe sortieren und die Gesamtzahl der nachgewiesenen Farben oder den Anteil an der Gesamtmenge, der von jeder Farbgruppe repräsentiert wird, 12,32,33,34 angeben. Dies kann durch Messung der Massen- oder Pelletzahl jeder Farbgruppe erreicht werden. Die Messung der Pelletzahl jeder Farbgruppe wird empfohlen, wenn bekannte oder vermutete systematische Unterschiede im Gewicht von Pellets aus verschiedenen Taxa bestehen. Systematische Unterschiede können durch die Pelletgröße oder die Menge an Nektar verursacht werden, die Sammler dem Pollen bei der Bildung eines Pellets hinzufügen.

Die Farbsortierung ist ein zeiteffizienter und einfacher Prozess, hat aber möglicherweise keine akzeptable Genauigkeit für einige Bestäubungsforschungsstudien, da verschiedene Pflanzentaxa ähnliche Pollenpelletfarben haben können^35,36. Darüber hinaus gibt es eine logistische Begrenzung für die Anzahl der verschiedenen Farbgruppen, in die Pollenpellets getrennt werden können. Daher ist die Trennung jedes einzelnen Pflanzentaxonpollens in eine eigene Pelletfarbgruppe in Bestäubungsstudien möglicherweise nicht immer möglich. Die morphologische Charakterisierung von Pollenkörnern mittels Lichtmikroskopie ergänzt häufig die Farbtrennung von Pellets, indem die Pollen von zwei oder mehr Taxa in Pellets derselben Farbgruppe unterschieden werden. Obwohl es üblich ist, Pollenkörner mehrerer Taxa in einer bestimmten Pollenpellet-Farbgruppe zu finden, umfassen einzelne Pollenpellets, die von einer Honigbiene gesammelt werden, im Allgemeinen ein vorherrschendes Taxon, möglicherweise mit anderen Taxa in geringen Mengen. Daher ist es üblich, taxonomische Treue in korbikulären Pollenpellets von Honigbienen anzunehmen. Pollenpellets von anderen Bestäubern, die kein Blütentreueverhalten aufweisen, wie Hummeln, enthalten oft viele Pflanzenarten und besitzen möglicherweise kein vorherrschendes Taxon. In Fällen, in denen quantitative Schätzungen der Taxaanteile in polyfloralen Pollenpellets gewünscht werden, sind mikroskopische Methoden, die Acetolyse einschließen, zusätzlich für eine ordnungsgemäße Analyse erforderlich.

Die Beurteilung morphologischer Merkmale von acetolysierten Pollenkörnern ist die gebräuchlichste Methode zur taxonomischen Identifizierung¹⁶. Das Acetolyseverfahren entfernt das Protoplasma des Pollenkorns, um diagnostische Merkmale freizulegen, die unter Lichtmikroskopie beobachtet werden können^37,38. Mit dieser Methode können Forscher verschiedene Taxa, die Häufigkeit von Taxa, die in bestimmten Anbausystemen gefunden werden, und vorherrschende Taxa von Pelletfarben^33,36 melden. Die Acetolyse ist die beste Analysetechnik zur Aufdeckung der Pollenmorphologie²⁸. Einige acetolysierte Pollenkörner, wie viele Rosaceae-Arten, können jedoch nicht allein durch Acetolyse und Lichtmikroskopie auf Gattungs- oder Artebene identifiziert werden. Forscher betrachten Rasterelektronenmikroskopie oder Metabarcoding als alternative Methoden, um eine Identifizierung auf Gattungs- oder Artebene zu erreichen. Diese alternativen Methoden liefern jedoch nur eine qualitative Taxonidentifikation und versäumen es, die Anteile verschiedener Pollenkorntaxa in polyfloralen Pollenpellets^{abzuschätzen 36,39}. Zudem ist der Aufwand und die notwendige Expertise für diese Methoden deutlich höher. Ein Vergleich dieser Identifizierungsmethoden ist in Tabelle 1 dargestellt.

Tabelle 1: Vergleich verschiedener Methoden der Pollensammlung und -identifizierung basierend auf Zeit, Kosten, Auflösung und Fachwissen. Visuelle Methoden (nur Farbsortierung) melden die Gesamtzahl der erkannten Farben oder den Anteil an der Gesamtfarbe, der von jeder Farbgruppe repräsentiert wird, als Metrik zur Bestimmung der Pollenquellen, bieten jedoch keine Taxonidentifikation.

Die verfügbaren Informationen über das Einfangen und Sortieren von Pollen und das Acetolysieren von Pollenkörnern sind vielfältig und oft über mehrere Quellen verteilt, die für Forscher in verschiedenen Bereichen unterschiedlich sind. Dieses Papier bietet detaillierte Einblicke in verschiedene Arten von Pollenfallen, die sowohl von Forschern als auch von Imkern verwendet werden können, um große Mengen an korbikulären Pollen effektiv zu sammeln. Ebenfalls enthalten sind Protokolle zur Vorbereitung von Pollenproben - durch Acetolyse, Färbung und Objektträgermontage - zur Identifizierung von Pflanzentaxa. Die hier beschriebenen Methoden sind umfassend und dienen als einzigartige Ressource zur Identifizierung vorherrschender Pflanzenarten, auf denen Honigbienen in einer bestimmten Landschaft nach Nahrung suchen, insbesondere in Anbausystemen. Ergebnisse, die auf diesen Methoden aus einer früheren Studie basieren, wurden vorgestellt und dokumentieren die Vielfalt der Pollenpelletfarben und Pflanzentaxa aus korbikulären Pollen, die von Honigbienen in fünf Kultursystemen gesammelt wurden¹⁴.

1. Sammeln von Rabenpollen von Honigbienenvölkern mit Pollenfallen

1. Bestimmen Sie, wann Pollen vom gewünschten Imkereistandort eingefangen werden sollen.
   HINWEIS: Ideale klimatische Bedingungen sind volle Sonneneinstrahlung, geringe Windgeschwindigkeiten, niedrige Luftfeuchtigkeit und kein vorhergesagter Niederschlag während des gewünschten Zeitraums für die Pollensammlung.
2. Wählen Sie optimale Honigbienenvölker aus, um Pollen innerhalb des Bienenhauses einzufangen.
   1. Beurteilen Sie die Stärke der Kolonien, indem Sie die Sammler zählen, die 2 Minuten lang zum Kolonieeingang zurückkehren. Wählen Sie Kolonien mit der höchsten Gesamtzahl zurückkehrender Sammler aus.
   2. Wählen Sie Bienenstöcke mit Holzwaren, die sich in gutem Zustand befinden, vorzugsweise ohne zusätzliche Eingänge und verzogene Deckel. Verwenden Sie Kolonien mit weniger alternativen Eingängen, da sie die Wahrscheinlichkeit erhöhen, dass sich die Sammler zum Falleneingang umorientieren.
   3. Wählen Sie nach Möglichkeit nach Süden ausgerichtete Bienenstockeingänge. Wenn Bienenstöcke palettiert werden, installieren Sie Pollenfallen auf jeder Kolonie, die auf einer bestimmten Palette in die gleiche Richtung zeigt, um das Abdriften von Sammlern in benachbarte Bienenstockeingänge zu vermeiden.
   4. Falls gewünscht, beurteilen Sie das Brutnest der Kolonie, indem Sie Rahmen auf das Vorhandensein von Larven untersuchen. Ausgewählte Kolonien mit relativ großen Mengen an Larven.
3. Installieren Sie Pollenfallen an den ausgewählten Honigbienenvölkern.
   HINWEIS: Die Installation unterscheidet sich je nach Art des Pollenfangs. Zu den Typen gehören a) Frontmontage, b) Bodenmontage, c) Aufsatzmontage oder d) Schneckenloch-Eingangsmontage. Weitere Informationen finden Sie im Diskussionsabschnitt.
   1. Bei Fallen an der Vorderseite befestigen Sie die Falle vor dem Eingang mit Klammern, Schrauben und Klebeband oder verbinden Sie die Falle mit Bungee-Kabeln, die um den Bienenstock gewickelt sind. Bei Fallen unten platzieren Sie die Falle unter der untersten Bienenstockbox und befestigen Sie den Falleneingang in der Nähe des ursprünglichen Eingangs. Bei Schneckenloch-Montagefallen befestigen Sie die Falle direkt vor einem Schneckenloch eines Bienenstockkastens mit Klammern, Schrauben und Klebeband. Bei Fallen von oben platzieren Sie die Falle über der obersten Bienenstockbox und unter dem Deckel.
4. Versiegeln Sie alle anderen möglichen Eingänge in die Kolonie mit nicht klebendem und formbarem Material wie Latex- oder Polyurethanschaum oder #8 Hardware-Tuch (2,7 mm Apertur) für Schneckenlöcher. Verwenden Sie Klebeband für kleine Risse.
5. Wenn Sie Fallen an der Vorderseite verwenden, platzieren Sie eine Barriere, z. B. eine Gummimatte, zwischen dem Sammelkorb und dem Gras, um Feuchtigkeitsschäden durch Tau zu vermeiden.
6. Betätigen Sie den Fangmechanismus der Pollenfalle 24 Stunden nach der Installation und vor Beginn des Tagesfluges (später Abend/früher Morgen).
   HINWEIS: Dieser Schritt ist ideal, aber nicht notwendig. Engagieren Sie Pollenfallen alle zwei Wochen, wenn Sie Pollen in denselben Kolonien während eines bestimmten Zeitraums fangen.
7. Sammeln Sie korbikuläre Pollen aus der Auffangschale, legen Sie sie in Plastiktüten oder Zentrifugenröhrchen und lagern Sie sie in einem Kühler mit Eis.
   1. Um die Vielfalt und Häufigkeit von Pollenarten zu beurteilen, z. B. in Ernährungsstudien auf Landschaftsebene, sammeln Sie Pollen in zwei oder drei 72-Stunden-Intervallen⁴⁰.
   2. Für die Analyse von Pestizidrückständen Pollen in Intervallen von 24 h bis 96 h mit einem Minimum von 3 g für die Verarbeitung^{sammeln 41}.
8. Reinigen Sie den Pollen, indem Sie Bienenteile und andere Bienenstockablagerungen entfernen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Einweghandschuhe beim Umgang mit Pollenproben und wechseln Sie die Einweghandschuhe zwischen den Proben. Verwenden Sie separate Werkzeuge, um Ablagerungen von den in jeder Falle gesammelten Pollen zu entfernen. Spülen und trocknen Sie, bevor Sie die Werkzeuge für eine weitere Charge eingeschlossener Pollen verwenden.
9. Lagern Sie Pollen bei -20 °C oder darunter, um seine Zusammensetzung zu erhalten, wenn Pollen zur Identifizierung der Pollenquelle, zur Mengenbewertung oder zur Analyse von Pestizidrückständen bestimmt sind^41,42.
10. Nachdem Sie die Fallen aus den Bienenstöcken entfernt haben, sterilisieren Sie alle Geräte in einer 5% igen Bleichlösung, spülen und trocknen Sie die Ausrüstung vor dem nächsten Gebrauch.

2. Pollenpellet-Farbsortierung zur nachgeschalteten Pollenquellenbestimmung und Mengenbewertung

1. Stellen Sie sicher, dass mindestens 20 g Pollenprobe vorhanden sind, mit der Sie arbeiten können. Mischen Sie die Pollenprobe gründlich in ihrem Beutel oder einem anderen Behälter geeigneter Größe, um eine homogene Mischung aller darin enthaltenen Pellets zu erhalten. Um unbeabsichtigte Verzerrungen im nächsten Schritt zu vermeiden, verdecken Sie die Farbzusammensetzung der Probe, bevor Sie eine Unterprobe aus dem Probenbeutel entfernen.
2. Mit einer Schaufel oder einem großen Löffel 10 g Pollen als repräsentative Teilprobe des Ganzen ausschöpfen. Gießen Sie langsam Pellets aus der Schaufel auf die Waage, bis das Display 10 g anzeigt. Wenn der erste Messlöffel nicht groß genug war, rufen Sie auf die gleiche Weise einen anderen Messlöffel aus der Probe ab.
   HINWEIS: Diese angegebenen Gewichtsanforderungen (20 g und 10 g) dienen nur als Beispiele. Die Forscher sollten die Menge der in jedem Schritt verwendeten Pollen an die spezifischen Bedürfnisse anpassen.
3. Entfernen Sie alle Bienenteile und andere Ablagerungen aus der 10-g-Teilprobe. Fügen Sie dann bei Bedarf etwas mehr Pollen aus der ursprünglichen Probe hinzu, um ein Gesamtgewicht von 10 g der Teilprobe zu erreichen.
4. Sortieren Sie jedes Pollenpellet aus der 10 g Unterprobe in eine Farbgruppe. Verwenden Sie sowohl Pollenfarbe als auch Textur, um zwischen Farbgruppen zu unterscheiden.
   HINWEIS: Einige Abweichungen innerhalb einer Gruppe werden erwartet, aber die Verwendung des Pantone-Farbleitfadens während der Sortierung kann die Konsistenz erhöhen.
5. Um mindestens 0,25 g jeder Farbgruppe für nachgeschaltete Schritte zu gewährleisten, legen Sie alle Pellets, die nicht ausreichend sind, um eine Farbgruppe von mindestens 0,25 g zu bilden, in eine verschiedene Gruppe. Benennen Sie jede einzelne Farbgruppe mithilfe der Pantone-Farbtabelle. Beschriften Sie die verschiedenen Gruppen misc.
6. Wiegen Sie jede Farbgruppe auf einem separaten Wiegepapier und/oder zählen Sie die Anzahl der Pellets in jeder Farbgruppe. Notieren Sie die Namen der Farbgruppen und Gewichte oder Zählungen in einem Datenblatt.
   HINWEIS: Die Entscheidung, ob die Anzahl der Pellets in jeder Farbgruppe gewogen oder gezählt werden soll, hängt von der Interessenmetrik des Forschers und den Projektzielen ab.
7. Erstellen Sie ein Mikrozentrifugenröhrchenetikett für jede Farbgruppe mit einem lösungsmittelbeständigen Stift und Klebepapiertubenetiketten. Geben Sie das aktuelle Datum, die Probenkennung, das Probenabholdatum und die Farbgruppennummer in das Etikett ein. Tragen Sie die Etiketten auf saubere, trockene 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen auf.
8. Wiegen Sie 0,25 g (± 0,05 g) Pollenpellets aus jeder Farbgruppe ab und geben Sie diese Menge in das entsprechend gekennzeichnete Mikrozentrifugenröhrchen.
   HINWEIS: Wenn der Pollen einer bestimmten Farbgruppe geringfügig abweicht, stellen Sie sicher, dass sich in jedem Röhrchen eine repräsentative Probe von Pellets befindet. Die Reagenzvolumina sowie die folgenden Inkubations- und Zentrifugationszeiten sind für 0,25 g Pollen geeignet. Verwenden Sie daher diese Pollenmenge in den Mikrozentrifugenröhrchen, die in der Acetolyse verwendet werden sollen. Dieses Protokoll sollte reichlich gefärbte Pollen für die nachgeschaltete Pflanzenquellenidentifizierung durch Lichtmikroskopie liefern. Bei Verwendung einer anderen Pollenmenge in der Acetolyse sollten die Besonderheiten des Reagenzvolumens und der Verarbeitungszeiten entsprechend angepasst werden.
9. Legen Sie den restlichen Pollen aus jeder Farbgruppe in einzelne Plastiktüten (ein Beutel pro Farbe), die mit dem Namen der Farbgruppe beschriftet sind. Bewahren Sie diese Beutel zusammen mit den anderen Teilen der entsprechenden Originalprobe bei -20 °C auf.
10. Mischen Sie die Pollen in der Tube gründlich mit einem sauberen Holzzahnstocher für 10 bis 15 s.

3. Vorbereitung für die Acetolyse

1. Bevor Sie zum ersten Mal mit einem Teil der Acetolyse beginnen, wenden Sie sich an die Abteilung für Umweltgesundheit und -sicherheit (EHS) der benannten Institution, um Anweisungen zum Umgang mit acetolysebedingten Reagenzien und Abfällen zu erhalten.
2. Beschaffen Sie Stammlösungen der folgenden Reagenzien und legen Sie sie gemäß den EHS-Richtlinien für die chemische Lagerung in den Abzug: 95% Ethanol; destilliertes Wasser; Eisessig, wasserfrei; konzentrierte Schwefelsäure; Glyzerin; und klarer Nagellack.
3. Bereiten Sie Stammlösungen der folgenden Reagenzien vor und legen Sie sie gemäß den EHS-Richtlinien für die chemische Lagerung in den Abzug: gesättigtes Natriumbicarbonat (8% w/v-Lösung in destilliertem Wasser); und Safranin O (1% w/v Lösung in 50% Ethanol).

4. Acetolyse

1. Führen Sie das Voracetolyseverfahren der Eisessigwäsche durch. Führen Sie die folgenden Schritte innerhalb des Abzugs mit Laborkittel, Augenschutz und Nitrilhandschuhen durch.
   1. Schalten Sie einen Heizblock auf 80 °C.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass eine Quetschflasche mit gesättigtem Natriumbicarbonat leicht zugänglich ist. Dies kann verwendet werden, um Säureverschüttungen im Abzug zu neutralisieren, wenn sie auftreten.
   2. Beschriften Sie ein Glasbecherglas für saure Abfälle, eines für Ethanolabfälle und eines für Acetolysemischungen.
   3. Erstellen Sie unter Verwendung zuvor vorbereiteter Stammlösungen Arbeitsaliquots der folgenden Reagenzien in gekennzeichneten, entsprechend großen Glasbechern: ~ 23,0 ml Eisessig; ~33,0 ml destilliertes Wasser; ~23,0 ml 95% Ethanol; ~25,0 mL Natriumbicarbonat (für säurekontaminierte feste Abfälle).
      HINWEIS: Dies sind die Volumina, die erforderlich sind, um die folgenden Acetolyseverfahren an insgesamt 10 Farbgruppenproben (10 Mikrozentrifugenröhrchen) durchzuführen.
   4. Fügen Sie langsam 500 μL Eisessig zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, das 0,25 g Farbgruppenpollen enthält. Während Sie das Röhrchen visuell untersuchen, rühren Sie den Pollen mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Legen Sie den gebrauchten Zahnstocher nach Gebrauch in das Natriumbicarbonat-Abfallbecherglas; Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Röhre.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Tube einen sauberen, neuen Zahnstocher. Stellen Sie sicher, dass der Deckel jeder Tube fest verschlossen ist.
   5. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 1.100 × g. Dekantieren Sie den Überstand aus den Rohren in das saure Abfallbecherglas. Berühren Sie dann sanft und kurz den offenen Mund der Röhre mit einem sauberen Papiertuch, um den Rest von Eisessig um den Rand des Röhrchens zu entfernen.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Pollenpellet beim Dekantieren von Überständen nicht zu verlieren.
2. Führen Sie das Acetolyseverfahren durch.
   HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte im Abzug mit Laborkittel, Augenschutz und Butylvinylhandschuhen durch.
   1. Bereiten Sie die Acetolysemischung (9:1 Eisessig: Schwefelsäure) vor, indem Sie zuerst 10,8 ml Eisessig (aus dem Arbeitsaliquot) in das mit Becherglas gekennzeichnete Acetolysegemisch geben. Dann werden unter Verwendung einer 1000-μL-Pipette mit 1250-μL-gefilterten Pipettenspitzen langsam 1200 μL (1,2 ml) konzentrierte Schwefelsäure aus der Stammlösung in das Acetolyse-Gemischbecherglas mit Eisessig gegeben. Entsorgen Sie die gebrauchte Pipettenspitze in das Becherglas mit Natriumbicarbonat.
      HINWEIS: Das Becherglas der Acetolysemischung kann sich warm anfühlen und die Mischung kann gelb werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, die dazu führen, dass die Mischung eine dunkle Farbe annimmt: (a) die Reagenzien können ihr Verfallsdatum überschritten haben, oder (b) es wurde zu viel Schwefelsäure hinzugefügt. In jedem Fall, wenn die Mischung dunkel wird, werfen Sie sie in das saure Abfallbecherglas und bereiten Sie eine frische Acetolysemischung vor.
   2. Rühren Sie die Acetolysemischung vorsichtig mit einem Glasstab oder Holzrührstab um, um sicherzustellen, dass sie homogenisiert ist. Legen Sie den gebrauchten Stab / Stock in das Becherglas mit Natriumbicarbonat.
   3. Geben Sie mit einer 1000-μL-Pipette mit 1250-μL-gefilterten Pipettenspitzen langsam 1000 μL Acetolysemischung aus dem Becherglas in jedes Röhrchen. Während der visuellen Inspektion der Röhre, rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Legen Sie den gebrauchten Zahnstocher nach Gebrauch in das Natriumbicarbonat-Abfallbecherglas.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher.
   4. Legen Sie die Proben auf den vorgeheizten (80 °C) Heizblock. Inkubieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten und rühren Sie jedes Röhrchen gründlich mit einem sauberen Zahnstocher nach der Hälfte der Inkubation. Legen Sie jeden verwendeten Zahnstocher nach Gebrauch in das Becherglas mit Natriumbicarbonat.
      HINWEIS: Lassen Sie keine Zahnstocher in den Proben; Die Säure löst sie auf.
3. Führen Sie das Waschverfahren nach der Acetolyse von Eisessig durch.
   HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte im Abzug mit Laborkittel, Augenschutz und Butylvinylhandschuhen durch.
   1. Fügen Sie langsam 500 μL Eisessig in jedes Röhrchen hinzu. Während der visuellen Inspektion der Röhre, rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Legen Sie den gebrauchten Zahnstocher nach Gebrauch in das Becherglas mit Natriumbicarbonat.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher. Stellen Sie sicher, dass der Deckel jeder Tube fest verschlossen ist.
   2. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 1.100 × g. Dekantieren Sie den Überstand aus jedem Rohr in das saure Abfallbecherglas. Berühren Sie dann sanft und kurz den offenen Mund der Röhre mit einem sauberen Papiertuch, um Restsäure um den Rand der Röhre zu entfernen.
   3. Spülen Sie die Butylvinylhandschuhe mindestens 30 s gründlich unter fließendem Wasser aus, entfernen Sie sie und lassen Sie sie trocknen.
      HINWEIS: Befolgen Sie die Richtlinien des Herstellers zur Wiederverwendung von Butylvinylhandschuhen.
4. Führen Sie drei Wasserspülungen für jede Probe durch. Führen Sie die folgenden Schritte innerhalb des Abzugs mit Laborkittel, Augenschutz und Nitrilhandschuhen durch.
   1. Fügen Sie 1000 μL destilliertes Wasser aus dem destillierten Wasserbecher in jedes Röhrchen hinzu. Während der visuellen Inspektion der Röhre, rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Legen Sie den Zahnstocher nach Gebrauch in das Natriumbicarbonat-Abfallbecherglas.
      HINWEIS: Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher. Stellen Sie sicher, dass der Deckel jeder Tube fest verschlossen ist.
   2. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 1.100 × g. Dekantieren Sie den Überstand aus den Röhrchen in das Becherglas aus Natriumbicarbonat. Berühren Sie dann sanft den offenen Mund der Röhre mit einem sauberen Papiertuch, um Restwasser um den Rand der Röhre herum zu entfernen.
   3. Wiederholen Sie die Schritte 4.4.1-4.4.2 zwei weitere Male, um insgesamt drei Wasserspülungen durchzuführen.
5. Führen Sie die Ethanolspülung für jede Probe durch.
   HINWEIS: Führen Sie die folgenden Schritte innerhalb des Abzugs mit Laborkittel, Augenschutz und Nitrilhandschuhen durch.
   1. Geben Sie mit einer 1000-μL-Pipette mit 1250-μL-gefilterten Pipettenspitzen 1000 μL 95% Ethanol aus dem Ethanolbecher in jedes Röhrchen. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in den ungefährlichen Abfall. Während der visuellen Inspektion der Röhre, rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird.
      HINWEIS: Legen Sie den Zahnstocher nach Gebrauch in das Natriumbicarbonat-Abfallbecherglas. Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher. Stellen Sie sicher, dass der Deckel jeder Tube fest verschlossen ist.
   2. Zentrifugieren Sie die Proben für 3 min bei 1.100 × g. Dekantieren Sie den Überstand aus den Röhrchen in das Ethanol-Abfallbecherglas und berühren Sie sanft den offenen Mund des Röhrchens mit einem sauberen Papiertuch, um Restethanol aus dem Röhrchen zu entfernen.
6. Tragen Sie Laborkittel, Augenschutz und Nitrilhandschuhe, um Proben zu färben. Mischen Sie die Safranin O-Beizstofflösung mit sanfter Inversion.
   1. Fügen Sie mit einer Einweg-Transferpipette aus Kunststoff 5-10 Tropfen Safranin O-Färbung zu jeder Tube hinzu. Während der visuellen Inspektion der Röhre, rühren Sie mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Lassen Sie den Zahnstocher in der Tube.
   2. Geben Sie mit einer 1000-μL-Pipette mit 1250-μL-gefilterten Pipettenspitzen 1000 μL 95% Ethanol aus dem Ethanolbecher in jedes Röhrchen. Entsorgen Sie die Pipettenspitze in den ungefährlichen Abfall. Während Sie das Röhrchen visuell untersuchen, rühren Sie mit dem Zahnstocher für 10-15 s um und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird. Legen Sie den gebrauchten Zahnstocher nach Gebrauch in den ungefährlichen Abfall.
   3. Stellen Sie sicher, dass der Deckel jeder Tube fest verschlossen ist. 3 min bei 1.100 × g zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand in das Ethanol-Abfallbecherglas.
      HINWEIS: Berühren Sie den Mund der Tube diesmal nicht mit einem Papiertuch.
   4. Fügen Sie 10-15 Tropfen Glycerin mit einer Einweg-Transferpipette aus Kunststoff hinzu. Während Sie das Röhrchen visuell untersuchen, rühren Sie den Inhalt des Röhrchens mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird.
      HINWEIS: Legen Sie den gebrauchten Zahnstocher nach Gebrauch in den ungefährlichen Abfall. Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher. Stellen Sie sicher, dass alle Tubenetiketten lesbar sind.
7. Lassen Sie die Röhrchen im Abzug offen, um das Ethanol für mindestens 2 h bei Raumtemperatur zu verdampfen. Überprüfen Sie die Proben auf Ethanolgeruch: Wenn er nachweisbar ist, sind die Proben nicht fertig und sollten getrocknet werden, bis sich der Ethanolgeruch auflöst.
8. Reinigen Sie alle Materialien und entsorgen Sie den Abfall. Schalten Sie sowohl die Zentrifuge als auch den Heizblock aus. Entsorgen Sie alle festen und flüssigen Abfälle in Übereinstimmung mit den Umweltgesundheits- und Sicherheitsrichtlinien der benannten Institution.
9. Bereiten Sie Objektträger für die Pollenidentifizierung vor; Beschriften Sie sie leserlich. Beschriften Sie einen Objektträger aus sauberem Glas entsprechend für jede Farbgruppe/Probe, die montiert wird. Während Sie das Röhrchen visuell untersuchen, rühren Sie die Probe mit einem sauberen Zahnstocher für 10-15 s und stellen Sie sicher, dass der Inhalt des Röhrchens gründlich gemischt wird.
   HINWEIS: Die Objektträgervorbereitung kann am Labortisch durchgeführt werden. Entsorgen Sie den Zahnstocher im ungefährlichen Abfall. Verwenden Sie für jede Probe einen sauberen, neuen Zahnstocher.
   1. Entfernen Sie mit einer sauberen Einweg-Transferpipette aus Kunststoff 1 Tropfen Pollenreste aus einem Röhrchen und legen Sie ihn in die Mitte des beschrifteten Objektträgers. Lassen Sie den Tropfen leicht ausbreiten. Legen Sie ein sauberes Deckglas über den Tropfen auf dem Objektträger.
   2. Nachdem der Objektträger getrocknet ist, versiegeln Sie das Deckglas mit klarem Nagellack auf dem Objektträger. Legen Sie einen kleinen Tropfen Politur auf jede Ecke des Deckglases und malen Sie einen Politurrand um den Umfang des Deckglases, wo es auf die Folie trifft. Lassen Sie den Nagellack vollständig trocknen und malen Sie eine zweite Schicht Lack um den Umfang des Deckglases.

Eine frühere Studie berichtete über die Bewertung der Vielfalt von Pollen, die von Honigbienen in den folgenden landwirtschaftlichen Kulturen gesammelt wurden: Mandel, Kirsche, Hochbusch-Heidelbeere, Hybridkarotte und Wiesenschaum¹⁴. Mit den beschriebenen Methoden wurden korbikuläre Pollen gesammelt, nach Farbe sortiert und die Pflanzenquellen jeder Pelletfarbgruppe identifiziert, um die Pollendiversität zu bewerten. Für jede Ernte wurden Pollenfallen an Populationen an mehreren Standorten installiert (Abbildung 1A). Die Menge an Pollen, die an jedem Standort gesammelt wurde, reichte aus, um die Anforderungen an das Probengewicht der Farbsortier- und Acetolyseanalysemethoden zu erfüllen. Jede Pollensammelprobe hatte mehrere unterscheidbare Farbgruppen (Abbildung 2 und Abbildung 3). In einigen Proben enthielten Pollenfarbgruppen nur 4-5 Pellets; Die meisten Gruppen hatten jedoch deutlich mehr als das und dienten somit als eigene markierte Farbgruppe für die Acetolyse (Abbildung 4 und Abbildung 5). Nach der Acetolyse (Abbildung 6) wurde die Hellfeldlichtmikroskopie verwendet, um jede Farbgruppe effektiv bis zu ihrem niedrigsten taxonomischen Rang zu identifizieren, indem die morphologischen Merkmale mit denen von Belegproben aus der Umgebung jedes Studienzentrums bestätigt wurden (Abbildung 7).

Abbildung 1: Pollenfallen, die an einem Honigbienenvolk installiert sind, um korbikuläre Pollen zu sammeln . (A) Fallen, die unten über dem Bienenstockboden und direkt über dem untersten Bienenstockkasten platziert sind. Andere Pollenfallenarten umfassen (B) Front-Mount und (C) Schnecken-Eingangs-Mount-Fallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 2: Fangmechanismus und Auffangschale der Pollenfalle. Zurückkehrende Pollensammler müssen sich durch den Maschenfangmechanismus quetschen, bevor sie ihren Bienenstock erreichen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3: Auffangschale der Pollenfalle. Korbikularpollen werden von den Beinen zurückkehrender Pollensammler durch die Pollenfalle abgekratzt und fallen in die Auffangschale. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 4: Sortieren einer Probe von korbikulären Pollen in Farbgruppen. Korbikularpollen können getrocknet und gewogen werden, nachdem sie in Farbgruppen sortiert wurden, um die Anteile der gesammelten Farbpellets zu melden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 5: Vier Gruppen von Pollenpellets, sortiert nach Farbe mit dem Pantone-Farbführer. Die Farbgruppen sind als (A) grau, Pantone 5855C, (B) braun, Pantone 7557C, (C) gelb, Pantone 458C und (D) hellbraun, Pantone 3547C gekennzeichnet.

Abbildung 6: Aufbau der Acetolyseausrüstung im Abzug. Der Wärmeblock, Reagenzien, Lösungsmittelabfälle und saure Abfallbehälter, beschriftete Bechergläser, Pipetten, Pipettenspitzen, Rührstäbchen und Mikrozentrifugenröhrchen befinden sich im Inneren des Abzugs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 7: Mikroskopische Aufnahme von gefärbten, acetolysierten Pollenkörnern. Viele Facetten von acetolysiertem Senf (Brassicaceae) Pollenkörnern bei 40-facher Vergrößerung. Maßstabsbalken = 50,398 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Pollen, die von Mandelkulturstandorten gesammelt wurden, wiesen eine relativ geringere Pollendiversität auf als Pollen anderer Kulturen, mit durchschnittlich 3,0 ± 0,5 Pelletfarben und 3,2 ± 1,2 Pflanzentaxa pro Standort (Tabelle 2)¹⁴. Die übrigen vier Kultursysteme wiesen eine höhere Pollendiversität mit durchschnittlich 6,0 ± 2,0 Pelletfarben und 8,0 ± 1,5 Pflanzentaxa pro Standort in Kirsche, 8,8 ± 1,4 Pelletfarben und 13,5 ± 2,0 Pflanzentaxa pro Standort in Hochbusch-Heidelbeere, 7,0 ± 1,0 Pelletfarben und 11,0 ± 0,0 Pflanzentaxa pro Standort in Hybridkarotten und 10,0 ± 0,0 Pelletfarben und 13,0 ± 1,5 Pflanzentaxa pro Standort in Wiesenschaum¹⁴ auf.

Tabelle 2: Diversität der von Honigbienen gesammelten korbikulären Pollen in fünf Kultursystemen. Zu den Diversitätsmetriken gehören die mittlere Anzahl der Pelletfarben (± SE), die mittlere Anzahl der Pflanzentaxa (± SE) und die identifizierte Gesamtzahl der Taxa. Diese Tabelle wurde von¹⁴ geändert. Abkürzung: SE = Standardfehler.

Verschiedene Pollenfallenstile haben ihre eigenen Vor- und Nachteile. Die Vorteile und Einschränkungen von vier häufig verwendeten Fallenarten, (1) Frontmontage, (2) Bodenmontage, (3) Schneckenloch und (4) Top-Mount Pollenfallen werden unten diskutiert. Traps an der Vorderseite sind die vielseitigste Ausführung (Abbildung 1B). Die Installation ist schnell und einfach; Es kann ohne Anheben von Bienenstockboxen durchgeführt werden, und diese Fallen passen auf jede Langstroth-Art von Bienenstockausrüstung. Da die Auffangschale vor der Kolonie sitzt, sammelt sie minimale Ablagerungen von der Kolonie. Die Auffangschale ist jedoch auch stärker äußeren Elementen ausgesetzt - Feuchtigkeit von Feldbewässerung, regnerischem oder feuchtem Wetter oder Tau kann durch die Auffangschale mit dem Pollen in Kontakt kommen, was den Pollen möglicherweise unbrauchbar macht, wenn die Pellets zu gesättigt werden, um sich zu trennen. Das Risiko einer Pollensättigung kann reduziert werden, indem das Einfangen bei vorhergesagten Regenfällen oder hoher Luftfeuchtigkeit vermieden wird. Das Platzieren einer Gummimatte unter der Falle und zusätzliches Abdeckmaterial (z. B. Dachpappe) auf dem Pollenfänger kann die Auffangwanne ebenfalls vor Witterungseinflüssen schützen.

Fallen, die unten montiert wurden, wurden verwendet, um Pollen für die Daten in diesem Papier zu sammeln (Abbildung 1A). Sie sind nicht so bequem zu installieren, da sie unter dem Brutnest der Kolonie platziert werden müssen. Die Installation ist zeitaufwendig und führt dazu, dass eine große Menge an Trümmern aus der Kolonie in die Falle fällt, wie Bienenteile und kleine Wachsstücke. Der Boden der Auffangwanne für die meisten hergestellten Bodenfallen besteht aus feinem Netz, das eine ordnungsgemäße Belüftung ermöglicht, um die gesammelten Pollen vor Feuchtigkeit zu schützen. Schneckenloch-Pollenfallen tragen dazu bei, die Desorientierung von Sammlern zu minimieren, wenn sie Schneckenlöcher hauptsächlich als Bienenstockeingänge anstelle des Eingangs durch das untere Brett des Bienenstocks verwenden (Abbildung 1C). Da die Auffangwanne für Schneckenloch-Pollenfallen sehr klein ist, muss sie häufig entleert werden, um ein Überlaufen der Auffangwanne zu vermeiden. Aufgrund seiner oberen Platzierung auf einem Bienenstock ist die Top-Mount-Pollenfalle am einfachsten zu installieren und zu entfernen, und die gesammelte Pollenprobe ist frei von Bienenstockablagerungen. Diese Fallenart ist jedoch besonders empfindlich gegenüber beschädigten Bienenstockgeräten, da die Auffangschale Feuchtigkeit ausgesetzt wäre, wenn der Deckel, die innere Abdeckung und die obere Bienenstockbox nicht ordnungsgemäß verschlossen sind.

Die hierin beschriebenen Protokolle erfordern die Auswahl von Kolonien mit großen adulten und Larvenpopulationen (Schritt 1.2). Diese Selektionsmethode soll sehr große Mengen an gefangenem Pollen aus diesen Kolonien produzieren. Kolonien mit beträchtlichen Nahrungspopulationen können bei der Installation der Fallen am Eingang stark überlastet sein. Die Auswahl eines großen Bienenstockeingangs verringert die Überlastung. Große Sammelpopulationen können auch sehr große Mengen an Pollen sammeln, die die Grenzen der Auffangschale überschreiten können. Verwenden Sie voluminöse Auffangschalen, wie sie bei den meisten Fallenarten unten oder oben zu sehen sind, und häufig leere Schalen, um große Mengen eingeschlossener Pollen aufzunehmen. Wenn das angestrebte Forschungsziel darin besteht, die von Kolonien in einem Bienenhaus gesammelten Pollenmengen zu bewerten, wählen Sie repräsentative Kolonien aus, anstatt die adulten und larvenen Populationen für die Selektion zu optimieren. Alle Arten von Pollenfallen blockieren den Bienenstockeingang und schaffen einen neuen Eingang, der sich räumlich vom ursprünglichen Eingang¹⁶ unterscheidet. Pollenfallen sammeln in der Regel keine Pollen, wenn Sammler bei der Installation nicht in der Lage sind, sich auf den neuen Eingang der Pollenfalle auszurichten. Diese Sammler treiben leicht zu benachbarten Bienenstöcken und kontaminieren möglicherweise andere Pollensammelproben, wenn sie mit einer Pollenfalle in einen anderen Bienenstock gelangen. Daher sollte den Sammlern mindestens 24 Stunden Zeit gegeben werden, sich an den neuen Eingang zu gewöhnen, indem der Fangmechanismus nach der Installation deaktiviert bleibt. Die Auswahl von Kolonien mit wenigen oder keinen zusätzlichen Bienenstockeingängen reduziert auch die Verwirrung bei der Orientierung am neuen Pollenfalleneingang.

Zusätzliche Bienenstockeingänge (z. B. Löcher und verzogene Deckel) sollten versiegelt werden, aber das Risiko, dass Sammler zu benachbarten Bienenstöcken abdriften, steigt, wenn diese Eingänge zu Beginn der Falleninstallation vorhanden sind. Sammler treiben auch leicht in andere Bienenstockeingänge, wenn eine Pollenfalle nur auf einem einzigen Bienenstock in einer Gruppe von palettierten Bienenstöcken installiert ist. Sammler driften seltener, wenn alle Bienenstöcke, die auf der Palette in die gleiche Richtung zeigen, Fallen installiert haben. Top-Mount Pollenfallen können aufgrund der erheblichen Entfernung zwischen dem Pollenfalleneingang und dem ursprünglichen Eingang des Bienenstocks ein höheres Risiko für Bienendrift darstellen. Für diese Studie wurden Pollenfallen an mehreren Honigbienenvölkern an jedem Versuchsstandort installiert, um die Variation der Pollenmenge und der Taxazusammensetzung zwischen jeder Honigbienenkolonie zu berücksichtigen. Daher sollten Pollenfallen auf mehreren Kolonien installiert werden, um robuste Pollensammlungen aus der Landschaft zu erzielen, da die Pollensammlung zwischen den Kolonien je nach Pflanzenart und Gesamtsammelmenge^12,13 stark variieren kann. Jede Pollenprobe hatte eine Sammelzeit von 7 Tagen. In zukünftigen Studien wird das Sammeln von Pollen in zwei oder drei aufeinanderfolgenden 72-Stunden-Intervallen die Genauigkeit der Pollenfutterschätzung erhöhen⁴⁰.

Da es eine hohe zeitliche Fluktuation in der Pollensammlung gibt, könnte die Pollenschätzungsgenauigkeit erhöht werden, indem der Pollensammelprozess in frühen, Spitzen- und späten Blütezeiten der anvisierten Anbausysteme wiederholt wird^24,27,39. Pollen sollten von mehreren Standorten gesammelt werden, wenn auch vom gleichen Anbausystem oder Landschaftstyp, wegen der erwarteten Unterschiede in der Menge und Pflanzenartenart zwischen den Imkereistandorten 14,27,33,43. Langfristiges Pollenfangen kann für Honigbienenvölker schädlich sein. Mögliche Auswirkungen sind eine reduzierte Brutaufzucht, eine Verkürzung der Larvenwachstumsperiode und Kannibalismus von Eiern und jungen Larven in den Bienenstöcken 19,44,45,46. Längere Zeiträume des Pollenfangs, wie die gesamte Vegetationsperiode, können die schädlichen Auswirkungen auf die Brutaufzucht in Kolonien verschlimmern. Pollenfang kann auch zu einer Verringerung der Honigproduktion und einer Erhöhung des Feuchtigkeitsgehalts von gelagertem Honig führen¹³. Rotierende Pollenfallen zwischen Kolonien in einem Bienenhaus bei der kontinuierlichen Überwachung einer Landschaft oder eines Anbausystems könnten den Schaden für Kolonien, die für den Pollenfang verwendet werden, mildern. Das Einschalten von Pollenfallen alle zwei Wochen verringert schädliche Auswirkungen, insbesondere den Verlust der Honigproduktion, wenn Pollen in denselben Kolonien über einen bestimmten Zeitraum gefangen werden¹³.

Darüber hinaus werden die Pollenfallen bevorzugt auf starke Völker gesetzt. Gelegentlich können die Pollenfallen unbeabsichtigt eingreifen. Dies könnte vermieden werden, indem der Pollenfallenmechanismus gesperrt wird, wenn das Sammeln von Pollenfallen nicht erwünscht ist. Pollenfallen entfernen nicht alle korbikulären Pollen von Honigbienensammlern. Die Fangeffizienz hängt vom Fallentyp, der Pollenpelletgröße, der Größe des Bienenkörpers, der Tageszeit und den Wetterbedingungen ab. Daher ist die korbikuläre Pollensammlung nicht konsistent, wenn Pollenfallen für verschiedene Pflanzenarten und Sammelzeiträume^25,26 verwendet werden. Kleinere Pollenpellets von Pflanzen wie Eucalyptus spp. und Tamarix spp. werden seltener von Pollenfallen gefangen²⁷. Bemerkenswerterweise wurde in dieser Studie kein Hochbusch-Heidelbeerpollen (Vaccinium corymbosum L.) von den Hochbusch-Blaubeersammelstellen gefunden, was frühere Beweise dafür unterstützt, dass Hochbusch-Blaubeer-Blaubeerpollenpellets zu klein für die Pollenfallensammlung^{sind 47}. Im Gegensatz dazu wurde Pollen aus Löwenzahn (Taraxacum officinale F.H. Wigg) in jedem Anbausystem in dieser Studie gefunden. Pollenpellets einiger Pflanzenarten können auch viel größer sein als andere, wie Taraxacum spp., und könnten möglicherweise bei der Analyse von Pollensammlungen aus Pollenfallen überrepräsentiert sein²⁷. Das Fangen einzelner Pollensammler und das manuelle Entfernen ihres korbikulären Pollens erhöht die Genauigkeit einer Pollenquellenbewertung, ist jedoch im Vergleich zur Verwendung von Pollenfallen sehr zeit- und ressourcenintensiv (Tabelle 1). Das Sortieren von Pollenpellets in Farbgruppen ist relativ einfach, obwohl es zeitaufwendig ist. Sofern es kein spezifisches Forschungsziel gibt, sollte die Menge an Pollenpellets auf 10 g oder weniger (für eine bestimmte Probe) begrenzt werden, um sie in Farbgruppen zu sortieren. Das Sortieren ganzer Proben, die größere Mengen als diese Menge enthalten, verlängert die für den Abschluss der Analyse erforderliche Zeit drastisch. Entscheidend ist jedoch, dass eine Pollenprobe sehr gut durchmischt ist, bevor ihr eine Teilprobe zur Farbsortierung entnommen wird. Wenn die ursprüngliche Probe nicht gemischt wird, kann dies zu einer Teilprobe führen, die nicht repräsentativ für das Ganze ist, was vermieden werden sollte.

Wenn der ursprüngliche Probenbehälter nicht genügend freien Platz enthält, um eine gründliche Mischung der Pollenpellets zu ermöglichen, sollte es ausreichen, die gesamte Probe in einen großen Plastikbeutel oder eine kleine Papiertüte zu legen, auch bei großen Proben. Hartplastikbehälter mit Deckel funktionieren ebenfalls. Das Mischen der Probe sollte vorsichtig erfolgen, damit Pollenpellets nicht zerquetscht oder anderweitig zerstört werden. Unbeabsichtigte Verzerrungen könnten unbewusst dazu überreden, "die hübschen violetten Pellets" herauszuschöpfen, wenn beispielsweise eine Teilprobe aus dem Ganzen entfernt wird. Daher sollte die Farbzusammensetzung der Probe beim Herausnehmen einer Teilprobe verdeckt werden. Auf diese Weise ist es wahrscheinlicher, eine Teilstichprobe zu erhalten, die wirklich repräsentativ für das Ganze ist. Diese Subsampling-Methode könnte jedoch nicht dazu führen, Pollenpellets auszuwählen, die in geringer Häufigkeit in der Probe vorhanden sind. Wenn also die Identifizierung jedes einzelnen Pflanzentaxons, das in der Stichprobe vertreten ist, ein Forschungsziel ist, ist die Erhebung einer Teilstichprobe nicht angemessen. Die gesamte Probe muss analysiert werden. Daher sollten Pellets in einer Glas-Petrischale sortiert werden. Sobald die Sortierung abgeschlossen ist, können entsprechende Seiten des Pantone-Farbführers unter der Schale platziert werden, um die Farbabstimmung zwischen der Anleitung und den sortierten Pollen zu erleichtern. Ein Beispiel hierfür ist in Abbildung 5 dargestellt.

Beim Einfangen von Pollen von Honigbienenvölkern, die zur Bestäubung in Kulturen platziert werden, sollten nicht mehr als zehn Gesamtfarbgruppen verwendet werden: neun Einzelfarben und eine "verschiedene" Farbgruppe, die sich aus den Minderheitenfarben in der Probe zusammensetzt. Eine vernünftige Begrenzung der maximalen Anzahl von Farbgruppen, in die eine Probe unterteilt werden kann, verhindert, dass sich der Forscher verzettelt, indem er Pellets endlos in immer mehr extrem spezifische Gruppen trennt, die nach Abschluss der Sortierung möglicherweise nicht genügend Mengen für die Acetolyse enthalten. Wenn Kolonien gefangen werden, die wahrscheinlich aus einem sehr vielfältigen Sortiment von Pflanzenarten suchen, können mehr Farbgruppen erforderlich sein, und die Protokolle sollten optimiert werden, um diese Anforderung widerzuspiegeln. Die vorliegende Studie konzentrierte sich auf die Pollenproben, die von Honigbienenvölkern gesammelt wurden, die Pflanzen bestäubten, und mehrere Taxa wurden häufig in einer Farbgruppe gefunden, ähnlich wie frühere Studien 29,30,31.

Die Acetolyse löst die Lipide, Proteine und organischen Ablagerungen von der Oberfläche der Pollenkörner auf und enthüllt die Unterscheidungsmerkmale des Exins, so dass die Körner leichter gefärbt und identifiziert werden können. Es ist eine alte und gebräuchliche Methodik, die in vielen Arten der Pollenforschung verwendet^{wird 37}. Die allgemeinen Schritte sind standardisiert; Sie unterscheiden sich wenig von Protokoll zu Protokoll. Die Besonderheiten der Zentrifugationsgeschwindigkeiten und -zeiten, der Inkubationstemperatur und -dauer, der pollenmengengesteuerten Reagenzienvolumina und sogar der Methode zur Entfernung von Überständen (Dekantieren vs. Pipettieren) müssen jedoch möglicherweise experimentell entsprechend den Forschungszielen und bis zu einem gewissen Grad der wahrscheinlich anzutreffenden Pollenarten optimiert werden⁴⁸. Tatsächlich kann die Acetolyse wichtige diagnostische Merkmale des Pollens von einigen Taxa wie Malvaceae und Orchidaceae entfernen³⁸. Daher sind nicht alle Pollen für Standardmethoden der Acetolyse geeignet. Wie bereits erwähnt, wurden diese Methoden in dieser Studie optimiert, um dominante Pflanzentaxonquellen von Pollen zu identifizieren, die von pflanzenbestäubenden Honigbienen gesammelt wurden. Details, die zu berücksichtigen sind, wenn die genaue Quantifizierung von Pollenkörnern Teil der Studie ist, wurden in diesem Papier nicht behandelt.

Der Einsatz von Lösungsmitteln und Säuren erfordert eine sorgfältige Planung, eine angemessene persönliche Schutzausrüstung (PSA) und eine verantwortungsvolle Abfallentsorgung (Abbildung 6). Es ist wichtig, dass Forscher den richtigen Weg zur Lagerung von Reagenzien und zur Entsorgung von Abfällen bestimmen, bevor sie mit einem Teil der Acetolyse beginnen. In diesem Labor werden Butylhandschuhe in jedem Teil des Prozesses verwendet, der Schwefelsäure und sogar Eisessig beinhaltet, da sie für beide Säuren weitaus bessere Abbau- und Permeationswerte aufweisen als Nitrilhandschuhe, ohne die Geschicklichkeit zu beeinträchtigen⁴⁹. Es wäre ratsam, die Sicherheitsleitlinien der jeweiligen Institution zu konsultieren, um Empfehlungen zu geeigneten Handschuhen und anderen PSA⁴⁹ zu erhalten. Die Zugabe von Eisessig vor dem Acetolyseschritt hilft, die Restfeuchte in der Probe zu entfernen und bereitet sie auf die wichtige Acetolysereaktion vor. Das Eisessigsäure-Schwefelsäure-Gemisch im Acetolyseschritt kann heftig mit Wasser reagieren, weshalb es wichtig ist, dass alle Glaswaren und Vorräte vollständig trocken sind und dass der Probe vor der Acetolyse jegliche Feuchtigkeit entzogen wird. Die Post-Acetolyse-Zugabe von Eisessig verdünnt und neutralisiert das Acetolysegemisch.

Insbesondere Ethanol und Eisessig können die Tinte von Mikrozentrifugenröhrchenetiketten auflösen, wenn diese Reagenzien auch mit lösemittelbeständigen Pens auf die Außenseite des Röhrchens tropfen. Überprüfen Sie die Tubenetiketten während des gesamten Prozesses häufig, um sicherzustellen, dass sie noch lesbar sind. Wenn es logistisch machbar ist, sollten Sie die Verwendung von LaserJet-gedruckten Etiketten als Schutz vor dieser Möglichkeit in Betracht ziehen. Die Art und Weise, wie Überstände dekantiert werden, beeinflusst, ob Reagenzien an der Außenseite der Mikrozentrifugenröhrchen heruntertropfen. Es ist wichtig, den Überstand mit einer selbstbewussten, glatten Hand zu dekantieren, was mit der Übung kommt. Es sollte darauf geachtet werden, dass Pollenproben aus dem Zentrifugenröhrchen während des Dekantierens nicht verloren gehen. Bei zu schnellem Dekantieren besteht die Gefahr, dass einige oder alle Pollenrückstände verloren gehen. Ein zu langsames Dekantieren kann dazu führen, dass der Überstand das Rohr hinunterläuft. Obwohl allgemein eine Inkubationstemperatur von 100 °C empfohlen wird, könnten Pollen bei dieser Temperatur in den in dieser Studie verwendeten Mengen (0,25 g) leicht "verkocht" werden, insbesondere wenn sie für etwas längere Zeiträume inkubiert^{werden 29}. Tatsächlich können Pollenkörner selbst bei 80 °C platzen oder anderweitig beschädigt werden, wenn sie zu lange in der Acetolysemischung verbleiben. Inkubationstemperatur und -dauer müssen sorgfältig bestimmt werden, um eine Zerstörung der Pollenkörner in der Probe zu vermeiden.

Die Färbung von Pollen erhöht die Definition und den Kontrast der Exine-Merkmale und erleichtert das Fotografieren und Identifizieren (Abbildung 7). Fünf Tropfen (aus einer Kunststofftransferpipette) von 1% Safranin O färbten effektiv 0,25 g Pollen. Verschiedene Pollen färben sich jedoch unterschiedlich. Wenn Pollenkörner zu leicht oder zu stark gefärbt sind, kann die Identifizierung schwierig sein. Wenn möglich, sollte das Volumen der Färbelösung, das benötigt wird, um die in der Studie erwarteten Pollenarten angemessen zu färben, vor Beginn der Verarbeitung der experimentellen Proben validiert werden. Wenn jedoch eine der experimentellen Proben nicht richtig gefärbt ist, kann sie korrigiert werden. Um eine zu stark gefärbte Pollenprobe aufzuhellen, spülen Sie die Probe mit Wasser und dann Ethanol ab. Wenn der Pollen nicht gut genug gefärbt ist, um Unterscheidungsmerkmale zu sehen, können ein paar zusätzliche Tropfen Fleck hinzugefügt werden. Der Fleck dieser Proben sollte vor der Zugabe von Glycerin überprüft werden. Ebenso kann etwas Versuch und Irrtum erforderlich sein, um das ideale Volumen von Glycerin für die Pollenreste zu bestimmen. Fünfzehn Tropfen Glycerin schützten die Proben in dieser Studie in geeigneter Weise vor dem Austrocknen und verdünnten gleichzeitig den Pollenrest auf eine Konzentration, die ideal für die nachgeschaltete Identifizierung mittels Lichtmikroskopie ist. Andere Mengen an Pollenrückständen können mehr oder weniger Glycerin erfordern, um Austrocknung zu verhindern und die Montage zu erleichtern.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir danken Dr. Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) für die Unterstützung bei der Farbsortierung und Acetolyseanalyse. Diese Forschung wurde durch Forschungsgelder unterstützt, die R.R.S. von der Oregon State Beekeepers Association zur Verfügung gestellt wurden.