Coleta e Identificação de Pólen das Colônias de Abelhas

Descrevemos métodos para coleta de pólen corbicular de abelhas de mel, bem como protocolos para classificação de cores, acetólise e preparação de slides de microscópio de pólen para identificação taxonômica. Além disso, apresentamos a cor da pelota e a diversidade taxonômica do pólen corbicular coletados em cinco sistemas de cultivo usando armadilhas de pólen.

Os pesquisadores frequentemente coletam e analisam pólen corbicular de abelhas de mel para identificar as fontes vegetais nas quais elas forragem para pólen ou para estimar a exposição de pesticidas de abelhas via pólen. Descrito aqui é um método eficaz de captura de pólen para coletar pólen corbicular de abelhas que retornam às suas colmeias. Este método de coleta resulta em grandes quantidades de pólen corbicular que podem ser usados para fins de pesquisa. As abelhas coletam pólen de muitas espécies vegetais, mas normalmente visitam uma espécie durante cada viagem de coleta. Portanto, cada pelota de pólen corbicular representa predominantemente uma espécie de planta, e cada pelota de pólen pode ser descrita por cor. Isso permite que a triagem de amostras de pólen corbicular por cor separe as fontes vegetais. Os pesquisadores podem ainda classificar o pólen corbicular analisando a morfologia dos grãos de pólen acetolisados para identificação taxonômica. Esses métodos são comumente utilizados em estudos relacionados a polinizadores como eficiência de polinização, dinâmica de forrageamento de polinizadores, qualidade da dieta e diversidade. Metodologias detalhadas são apresentadas para a coleta de pólen corbicular usando armadilhas de pólen, triagem de pólen por cor e grãos de pólen acetolyzing. Também são apresentados resultados relativos à frequência das cores de pelotas e taxa de pólen corbicular coletado de abelhas de mel em cinco diferentes sistemas de cultivo.

A abelha ocidental (Apis mellifera L.) é uma importante polinizadora de muitas culturas agrícolas que dependem da polinização das abelhas¹. Por mais de uma década, foram relatadas perdas significativas das colônias de abelhas^em 2,3,4,5,6,7,8,9. Vários fatores , incluindo parasitas e doenças, má nutrição e pesticidas - foram implicados nestes declínios das colônias¹⁰. A má nutrição pode ser atribuída à intensificação agrícola e à perda do habitat^{forrageamento 11}. É imprescindível compreender os recursos florais utilizados pelas abelhas em diferentes paisagens para melhorar a nutrição das abelhas e auxiliar nos esforços de conservação das abelhas. O pólen é a principal fonte de proteínas, lipídios, vitaminas e minerais para abelhas e tem sido usado em muitos estudos agrícolas e ecológicos para entender as preferências de forrageamento de abelhas em nível colônia, avaliar o impacto da captura de pólen nas colônias de abelhas de mel e determinar a exposição a pesticidas às abelhas 12,13,14.

Abelhas de mel recolhem pólen de flores, embalam pólen em pelotas em seu corbicula - uma cesta de pólen tibial em seu traseiro - e retornam à colônia para armazenamento. O pólen corbicular pode ser removido dos forasteiros capturando-os na entrada da colmeia ou nas flores, resfriando-os brevemente para imobilizá-los e, em seguida, removendo as pelotas de pólen de suas patas traseiras com fórceps. O processo trabalhoso de coleta manual de pólen corbicular de forasteiros capturados individualmente é lento e ineficiente se se requer uma quantidade considerável de pólen. Um método mais simples e eficiente de coletar grandes volumes de pólen é aprisionar pelotas de pólen corbicular de abelhas de mel nas entradas da colmeia. As armadilhas de pólen são projetadas para desalojar pólen corbicular das pernas dos intrusos de pólen que retornam quando entram na colmeia¹⁵. Os forasteiros devem espremer através de orifícios de malha que são dimensionados para permitir por pouco a passagem de um corpo trabalhador de abelhas.

À medida que a abelha passa por um desses buracos, as pelotas de pólen maiores são raspadas de suas pernas e caem em uma bandeja de coleta¹⁶. Estudos têm demonstrado que a captura de pólen estimula os forasteiros a coletar mais pólen, aumentando assim a eficiência da polinização das culturas circundantes e a vegetação^em 17,18,19,20. As metodologias de coleta de pólen também podem ser utilizadas para entender a forragem utilizada pelas abelhas na paisagem como o primeiro passo para determinar a quantidade, a qualidade e a taxa das espécies de plantas em floração. Metodologias eficazes de captura de pólen facilitam tanto a pesquisa de polinização quanto a nutrição de abelhas. Uma comparação desses métodos de coleta de pólen é ilustrada na Tabela 1. O comportamento de forrageamento de pólen mudará com base na necessidade da colônia de pólen armazenado em relação aos seus níveis populacionais de ovos e larvas^21,22. Como essas mudanças incluem intensidade de coleta variada, a alta variação na quantidade de pólen é frequentemente esperada entre colônias no mesmo local e entre diferentes locais do mesmo sistema de cultivo ou tipo paisagem^23,24. Aumentar o número de colônias e locais para capturar pólen ajudará a acomodar essa variação.

As armadilhas de pólen variam em eficiência^25,26. O tamanho das pelotas de pólen coletadas pelas abelhas variam entre as espécies vegetais e pode mudar com base nos níveis de pólen na colônia ^27,28. Isso representa o potencial para que pelotas de pólen menores sejam sub-representadas e pelotas maiores sejam superrepresentadas em amostras coletadas através de armadilhas de pólen. As abelhas adultas variam em tamanho corporal, o que também pode afetar a representação do pólen coletado nas armadilhas. Há também espécies vegetais que produzem predominantemente néctar que não serão detectadas se apenas avaliarem o pólen coletado em algumas paisagens. A eficiência da captura também é impactada pela deriva e desorientação do forasteiro, que é influenciada pelo tipo de armadilha de pólen e pela condição do equipamento colmeia. Este problema pode ser mitigado por meio da empregabilidade de técnicas especificadas neste artigo. Os pesquisadores podem considerar técnicas adicionais de pesquisa, como contar a visitação de flores por forasteiros, para complementar os resultados das preferências de forrageamento em nível de colônia. Um método útil para avaliar a diversidade de pólen é classificar pólen corbicular por cor. Embora as abelhas sejam forjas generalistas, elas também exibem fidelidade de flores, onde coletam pólen das mesmas espécies vegetais no mesmo local durante qualquer viagem de coleta. Com base nesse comportamento de forrageamento, supõe-se que qualquer pellet de pólen corbicular é predominantemente representada por uma única espécie vegetal 27,29,30,31. Assim, os cientistas podem descrever a diversidade de pólen classificando o pólen corbicular por cor de pelota e relatando o número total de cores detectadas ou a proporção do total representado por cada grupo de cores 12,32,33,34. Isso pode ser feito medindo a contagem de massa ou pelotas de cada grupo de cores. A medição da contagem de pelotas de cada grupo de cores é sugerida se há diferenças sistemáticas conhecidas ou suspeitas no peso das pelotas de diferentes taxas. Diferenças sistemáticas podem ser causadas pelo tamanho da pelota ou pela quantidade de néctar que os forasteiros adicionam ao pólen ao formar uma pelota.

A classificação de cores é um processo eficiente e simples, mas pode não ter precisão aceitável para alguns estudos de pesquisa de polinização, pois diferentes taxas de plantas podem ter cores de pelotas de pólen semelhantes^35,36. Além disso, há um limite logístico para o número de grupos de cores distintas que pelotas de pólen podem ser separadas. Assim, a separação de cada pólen de imposto de plantas individual em seu próprio grupo de cores de pelotas distintas pode nem sempre ser possível em estudos de polinização. A caracterização morfológica dos grãos de pólen através da microscopia leve muitas vezes complementa a separação de cores das pelotas, distinguindo o pólen de dois ou mais taxas em pelotas do mesmo grupo de cor. Embora, é comum encontrar grãos de pólen de taxa múltipla em um dado grupo de cor de pelota de pólen, pelotas individuais de pólen coletadas por uma abelha de mel geralmente compreendem um imposto predominante, possivelmente com outras taxas em pequenas quantidades. Assim, é comum assumir fidelidade taxonômica em pelotas de pólen corbicular de abelhas de mel. Pelotas de pólen de outros polinizadores que não apresentam comportamento de fidelidade de flores, como abelhas, muitas vezes contêm muitas espécies de plantas e podem não possuir um taxon predominante. Nos casos em que são desejadas estimativas quantitativas de proporções tributárias em pelotas de pólen polifloral, métodos microscópicos que incluem acetrólise são adicionalmente necessários para a análise adequada.

Avaliar características morfológicas de grãos de pólen acetolisados é o método mais comum para identificação taxonômica¹⁶. O procedimento de acetrólise remove o protoplasma do grão de pólen para expor características diagnósticas que podem ser observadas sob microscopia leve^37,38. Com esse método, os pesquisadores podem relatar taxas diferentes, frequência de taxa encontrada em sistemas específicos de cultivo e taxa predominante de cores de^{pelotas 33,36}. Acetolise é a melhor técnica analítica para revelar morfologia de pólen²⁸. No entanto, alguns grãos de pólen acetolisados, como muitos tipos de Rosaceae, não podem ser identificados ao nível do gênero ou espécie através de acetolise e microscopia leve sozinho. Os pesquisadores consideram a microscopia eletrônica ou a metabarcos como métodos alternativos para alcançar a identificação do gênero ou nível de espécie. Esses métodos alternativos, no entanto, apenas fornecem identificação de taxon qualitativos e não conseguem estimar as proporções de diferentes taxas de grãos de pólen nas pelotas de pólen polifloral^36,39. Além disso, a despesa e a expertise necessária são consideravelmente maiores para esses métodos. A comparação desses métodos de identificação é ilustrada na Tabela 1.

Tabela 1: Comparação de diferentes métodos de coleta e identificação de pólen com base no tempo, despesa, resolução e perícia. Os métodos visuais (somente classificação de cores) relatam o número total de cores detectadas ou a proporção do total representado por cada grupo de cor como métrica para determinar as fontes de pólen, mas não fornecem identificação de taxon.

As informações disponíveis sobre captura e triagem de grãos de pólen e acetolyzing são diversas e muitas vezes espalhadas por múltiplas fontes, variando para pesquisadores em diferentes campos. Este artigo oferece insights detalhados sobre diferentes tipos de armadilhas de pólen que podem ser usadas por pesquisadores e apicultores para coletar efetivamente grandes volumes de pólen corbicular. Também são fornecidos protocolos para preparação de amostras de pólen - por acetólise, coloração e montagem de slides - para identificação de taxas vegetais. As metodologias aqui detalhadas são abrangentes e servem como um recurso único para identificar espécies vegetais predominantes nas quais as abelhas forragem em uma determinada paisagem, particularmente em sistemas de cultivo. Foram apresentados achados baseados nesses métodos de um estudo anterior e documentam a diversidade de cores de pelotas de pólen e taxa vegetal a partir do pólen corbicular coletado pelas abelhas em cinco sistemas de cultivo¹⁴.

1. Coleta de pólen corbicular de colônias de abelhas usando armadilhas de pólen

1. Determine quando prender pólen do local apiário desejado.
   NOTA: As condições climáticas ideais incluem exposição total ao sol, baixas velocidades do vento, baixa umidade e nenhuma precipitação prevista durante o período desejado para coleta de pólen.
2. Selecione colônias de abelhas de mel ideais para capturar pólen dentro do local apiário.
   1. Avalie a força da colônia contando os forasteiros que retornam à entrada da colônia por 2 minutos. Selecione colônias com o maior número total de forasteiros retornando.
   2. Selecione colmeias com madeiras que estão em boas condições, de preferência sem entradas extras e tampas deformadas. Use colônias com menos entradas alternativas, pois eles têm maior probabilidade de retornar forasteiros reorientando para a entrada da armadilha.
   3. Selecione entradas de colmeia voltadas para o sul sempre que possível. Se as colmeias forem paletizadas, instale armadilhas de pólen em cada colônia que esteja na mesma direção em uma determinada paleta para evitar a deriva de forasteiros nas entradas de colmeias vizinhas.
   4. Se desejar, avalie o ninho de ninhadas da colônia inspecionando quadros para a presença de larvas. Selecione colônias com quantidades relativamente grandes de larvas.
3. Instale armadilhas de pólen nas colônias de abelhas selecionadas.
   NOTA: A instalação difere com base no tipo de armadilha de pólen. Os tipos incluem a) montagem frontal, b) suporte inferior, c) montagem superior ou d) montagem de entrada de buraco de seção. Consulte a seção de discussão para obter detalhes.
   1. Para armadilhas de montagem frontal, conecte a armadilha na frente da entrada com grampos, parafusos e fita, ou conecte a armadilha a cabos de bungee enrolados ao redor da colmeia. Para armadilhas de suporte inferior, coloque a armadilha sob a caixa mais baixa da colmeia e fixe a entrada da armadilha perto da entrada original. Para armadilhas de montagem de orifício, conecte a armadilha diretamente em frente a um orifício de uma caixa de colmeia usando grampos, parafusos e fita. Para armadilhas de montagem superior, coloque a armadilha acima da caixa de colmeia superior e abaixo da tampa.
4. Sele todas as outras entradas possíveis na colônia usando material não adesivo e moldável, como látex ou espuma de poliuretano, ou pano de hardware #8 (abertura de 2,7 mm) para orifícios de auger. Use fita adesiva para pequenas rachaduras.
5. Se usar armadilhas de montagem frontal, coloque uma barreira, como um tapete de borracha, entre a cesta de coleta e a grama para evitar danos causados pela umidade do orvalho.
6. Acione o mecanismo de captura da armadilha de pólen 24 h após a instalação e antes do início do voo de forrageamento do dia (final da noite/madrugada).
   NOTA: Este passo é ideal, mas não necessário. Envolva armadilhas de pólen a cada duas semanas se prender pólen nas mesmas colônias durante um determinado período.
7. Recolhe o pólen corbicular da bandeja de coleta, coloque-o em sacos plásticos ou tubos de centrífugas e armazene em um refrigerador com gelo.
   1. Para avaliar a diversidade e abundância de espécies de pólen, por exemplo, estudos nutricionais em nível paisagístico, coletar pólen em dois ou três intervalos de 72h⁴⁰.
   2. Para análise de resíduos de pesticidas, colete pólen em intervalos de 24h a 96h com mínimo de 3 g para processamento^{de 41}.
8. Limpe o pólen removendo partes de abelhas e outros detritos da colmeia.
   NOTA: Use luvas descartáveis ao manusear amostras de pólen e troque as luvas descartáveis entre as amostras. Use ferramentas separadas para remover detritos do pólen coletados em cada armadilha. Enxágüe e seque antes de usar as ferramentas para outro lote de pólen preso.
9. Armazene pólen a -20 °C ou abaixo para manter sua integridade composicional se o pólen for destinado à identificação da fonte de pólen, avaliação da quantidade ou análise de resíduos de pesticidas^41,42.
10. Depois de remover as armadilhas das colmeias, esterilize todos os equipamentos em uma solução de alvejante de 5%, enxágue e seque o equipamento antes do próximo uso.

2. Classificação de cor de pelota de pólen para identificação de origem de pólen a jusante e avaliação da quantidade

1. Certifique-se de que há pelo menos 20 g de amostra de pólen para trabalhar. Misture minuciosamente a amostra de pólen em seu saco ou outro recipiente de tamanho adequado para obter uma mistura homogênea de todas as pelotas ali contidas. Para evitar viés não intencional na próxima etapa, obscureça a composição de cores da amostra da vista antes de remover uma subsamplega do saco de amostras.
2. Usando um scooper ou colher grande, retire 10 g de pólen como subsample de representação do todo. Despeje lentamente pelotas do scooper na balança até que o visor leia 10 g. Se a primeira colher não foi grande o suficiente, recupere outra colher da amostra da mesma forma.
   NOTA: Estes requisitos de peso especificados (20 g e 10 g) servem apenas como exemplos. Os pesquisadores devem ajustar a quantidade de pólen utilizada em cada etapa conforme apropriado para necessidades específicas.
3. Remova todas as partes das abelhas e outros detritos da subsample de 10 g. Em seguida, se necessário, adicione um pouco mais de pólen da amostra original para alcançar um peso total de 10 g da subsamplez.
4. Classifique cada pelota de pólen da subsampleção de 10 g em um grupo de cores. Use cor e textura de pólen para diferenciar entre grupos de cores.
   NOTA: É esperada alguma variação dentro de um grupo, mas usar o guia de cores Pantone durante a classificação pode aumentar a consistência.
5. Para garantir pelo menos 0,25 g de cada grupo de cores para degraus a jusante, coloque quaisquer pelotas que não sejam abundantes o suficiente para formar um grupo de cores de pelo menos 0,25 g em um grupo diverso. Nomeie cada grupo de cores individual usando o guia de cores Pantone. Rotule o grupo misc diverso.
6. Pesar cada grupo de cores em um papel de pesagem separado e/ou contar o número de pelotas em cada grupo de cores. Registo os nomes e pesos do grupo colorido ou conta com uma folha de dados.
   NOTA: Escolher se pesar ou contar o número de pelotas em cada grupo de cores depende da métrica de interesse do pesquisador e das metas do projeto.
7. Crie uma etiqueta de tubo de microcentrifuge para cada grupo de cores usando uma caneta resistente a solventes e etiquetas de tubo de papel adesivo. Inclua a data atual, identificador de amostras, data da coleta da amostra e número do grupo de cores no rótulo. Aplique as etiquetas em tubos de microcentrifuuge limpos e secos de 2 mL.
8. Pesar 0,25 g (± 0,05 g) de pelotas de pólen de cada grupo de cores, e coloque essa quantidade no tubo de microcentrifuge devidamente rotulado.
   NOTA: Se houver uma pequena variação de cor ou textura no pólen de um determinado grupo de cores, certifique-se de que há uma amostra representativa de pelotas dentro de cada tubo. Os volumes de reagentes e os tempos de incubação e centrifugação que se seguem são apropriados para 0,25 g de pólen. Portanto, use essa quantidade de pólen nos tubos de microcentrifuuge para ser usado na acetólise. Este protocolo deve fornecer pólen amplo e manchado para identificação de fonte de planta a jusante por microscopia leve. Se utilizar uma quantidade diferente de pólen na acetólise, as especificidades do volume de reagentes e dos tempos de processamento devem ser ajustadas em conformidade.
9. Coloque o pólen restante de cada grupo de cores em sacos plásticos individuais (um saco por cor) rotulados com o nome do grupo de cor. Armazene essas sacolas com as outras partes da amostra original apropriada no armazenamento de -20 °C.
10. Misture bem o pólen no tubo com um palito de dente de madeira limpo para 10 a 15 s.

3. Preparação para acetolise

1. Antes de iniciar qualquer parte da acetálise pela primeira vez, entre em contato com o departamento de saúde e segurança ambiental (EHS) da instituição designada para obter instruções sobre como os reagentes e resíduos relacionados à acetolise devem ser tratados.
2. Obtenha soluções de estoque dos seguintes reagentes e coloque-os na capa de fumaça de acordo com as diretrizes da EHS para armazenamento químico: 95% de etanol; água destilada; ácido acético glacial, anidra; ácido sulfúrico concentrado; Glicerina; e esmalte claro.
3. Preparar soluções de estoque dos seguintes reagentes e colocá-los na capa de fumaça de acordo com as diretrizes da EHS para armazenamento químico: bicarbonato de sódio saturado (solução de 8% w/v em água destilada); e safranin O (solução de 1% w/v em 50% de etanol).

4. Acetolise

1. Realize o procedimento pré-acetolise da lavagem de ácido acético glacial. Realize os seguintes passos dentro do capô da fumaça com jaleco, proteção ocular e luvas de nitrito.
   1. Ligue um bloco de calor a 80 °C.
      NOTA: Certifique-se de que uma garrafa de espremer bicarbonato de sódio saturado seja facilmente acessível. Isso pode ser usado para neutralizar derramamentos de ácido no capô da fumaça se ocorrerem.
   2. Rotule um copo de vidro para resíduos ácidos, um para resíduos de etanol e outro para mistura de acetrólise.
   3. Utilizando soluções de estoque previamente preparadas, crie alíquotas de trabalho dos seguintes reagentes em bicos de vidro rotulados e de tamanho apropriado: ~23,0 mL de ácido acético glacial; ~33,0 mL de água destilada; ~23,0 mL de 95% de etanol; ~25,0 mL de bicarbonato de sódio (para resíduos sólidos contaminados por ácido).
      NOTA: Estes são os volumes necessários para completar os seguintes procedimentos de acetolise em um total de 10 amostras de grupo de cores (10 tubos de microcentrifuuge).
   4. Adicione lentamente 500 μL de ácido acético glacial a cada tubo de microcentrifuuge contendo 0,25 g de pólen de grupo colorido. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa o pólen com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Coloque o palito usado no béquer de resíduos de bicarbonato de sódio após o uso; repetir este processo para cada tubo.
      NOTA: Use um palito novo e limpo para cada tubo. Certifique-se de que a tampa de cada tubo está bem fechada.
   5. Centrifugar as amostras por 3 min a 1.100 × g. Decante o supernatante dos tubos para o béquer de resíduos ácidos. Em seguida, toque suave e brevemente na boca aberta do tubo com uma toalha de papel limpa para remover ácido acético glacial residual ao redor da borda do tubo.
      NOTA: Tenha cuidado para não perder a pelota de pólen ao decantar sobrenantes.
2. Realize o procedimento de acetálise.
   NOTA: Realize os seguintes passos dentro do capô da fumaça com jaleco, proteção ocular e luvas de vinil butil.
   1. Prepare a mistura de acetolise (ácido acético glacial 9:1:ácido sulfúrico) adicionando primeiro 10,8 mL de ácido acético glacial (da alíquota de trabalho) à mistura de acetolise rotulada de béquer. Em seguida, usando uma pipeta de 1000 μL equipada com pontas de pipeta filtrada de 1250 μL, adicione lentamente 1200 μL (1,2 mL) de ácido sulfúrico concentrado da solução de estoque à mistura de acetálise que contém ácido acético glacial. Descarte a ponta de pipeta usada no béquer de bicarbonato de sódio.
      NOTA: O béquer da mistura de acetolise pode ficar quente ao toque, e a mistura pode ficar amarela. Existem duas possibilidades que fazem com que a mistura gire uma cor escura: (a) os reagentes podem ter passado das datas de validade, ou (b) muito ácido sulfúrico pode ter sido adicionado. De qualquer forma, se a mistura ficar escura, descarte-a no béquer de resíduos ácidos e prepare uma mistura de acetrólise fresca.
   2. Mexa delicadamente a mistura de acetálise com uma vara de vidro ou uma vara de mexida de madeira para garantir que ela seja homogeneizada. Coloque a haste/vara usada no béquer de bicarbonato de sódio.
   3. Usando uma pipeta de 1000 μL com pontas de pipeta filtradas de 1250 μL, adicione lentamente 1000 μL de mistura de acetolise do béquer a cada tubo. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Coloque o palito usado no béquer de resíduos de bicarbonato de sódio após o uso.
      NOTA: Use um palito novo e limpo para cada amostra.
   4. Coloque as amostras no bloco de calor pré-aquecido (80 °C). Incubar os tubos por 5 minutos, mexendo cada tubo completamente com um palito limpo no meio da incubação. Coloque cada palito usado no béquer de bicarbonato de sódio após o uso.
      NOTA: Não deixe palitos nas amostras; o ácido irá dissolvê-los.
3. Realize o procedimento de lavagem de ácido acético glacial pós-acetólise.
   NOTA: Realize os seguintes passos no capô da fumaça com jaleco, proteção ocular e luvas de vinil butil.
   1. Adicione lentamente 500 μL de ácido acético glacial a cada tubo. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Coloque o palito usado no béquer de bicarbonato de sódio após o uso.
      NOTA: Use um palito novo e limpo para cada amostra. Certifique-se de que a tampa de cada tubo está bem fechada.
   2. Centrifugar as amostras por 3 min a 1.100 × g. Decante o supernatante de cada tubo no béquer de resíduos ácidos. Em seguida, toque suave e brevemente na boca aberta do tubo com uma toalha de papel limpa para remover ácido residual ao redor da borda do tubo.
   3. Enxágue completamente as luvas de vinil butil em água corrente por pelo menos 30 s, remova-as e coloque-as para secar.
      NOTA: Siga as orientações do fabricante sobre a reutilização de luvas de vinil butil.
4. Realize três lava-águas para cada amostra. Realize os seguintes passos dentro do capô da fumaça com jaleco, proteção ocular e luvas de nitrito.
   1. Adicione 1000 μL de água destilada do béquer de água destilado a cada tubo. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Coloque o palito no béquer de resíduos de bicarbonato de sódio após o uso.
      NOTA: Use um palito novo e limpo para cada amostra. Certifique-se de que a tampa de cada tubo está bem fechada.
   2. Centrifugar as amostras por 3 min a 1.100 × g. Decante o supernatante dos tubos para o béquer de bicarbonato de sódio. Em seguida, toque suavemente a boca aberta do tubo com uma toalha de papel limpa para remover água residual ao redor da borda do tubo.
   3. Repetição de passos 4.4.1-4.4.2 duas vezes adicionais para um total de três lava-águas.
5. Realize a lavagem de etanol para cada amostra.
   NOTA: Realize os seguintes passos dentro do capô da fumaça com jaleco, proteção ocular e luvas de nitrilho.
   1. Utilizando uma pipeta de 1000 μL com pontas de pipeta filtrada de 1250 μL, adicione 1000 μL de 95% de etanol do béquer de etanol a cada tubo. Descarte a ponta da pipeta em resíduos não perigosos. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado.
      NOTA: Coloque o palito no béquer de resíduos de bicarbonato de sódio após o uso. Use um palito novo e limpo para cada amostra. Certifique-se de que a tampa de cada tubo está bem fechada.
   2. Centrifugar as amostras por 3 min a 1.100 × g. Decante o supernatante dos tubos para o copo de etanol, e toque suavemente na boca aberta do tubo com uma toalha de papel limpa para remover o etanol residual do tubo.
6. Use jaleco, proteção ocular e luvas de nitrito para colorir amostras. Misture a solução de estoque de manchas Safranin O usando inversão suave.
   1. Usando uma pipeta de transferência de plástico descartável, adicione 5-10 gotas de mancha safranin O a cada tubo. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Deixe o palito no tubo.
   2. Utilizando uma pipeta de 1000 μL com pontas de pipeta filtrada de 1250 μL, adicione 1000 μL de 95% de etanol do béquer de etanol a cada tubo. Descarte a ponta da pipeta em resíduos não perigosos. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa com o palito de dente por 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado. Coloque o palito usado nos resíduos não perigosos após o uso.
   3. Certifique-se de que a tampa de cada tubo está bem fechada. Centrifugar por 3 min a 1.100 × g. Decante o supernatante no béquer de resíduos de etanol.
      NOTA: Não toque na boca do tubo com uma toalha de papel desta vez.
   4. Adicione 10-15 gotas de glicerina em cada tubo usando uma pipeta de transferência descartável de plástico. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa o conteúdo do tubo com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado.
      NOTA: Coloque o palito usado nos resíduos não perigosos após o uso. Use um palito novo e limpo para cada amostra. Certifique-se de que todas as etiquetas do tubo são legíveis.
7. Deixe os tubos abertos no capô da fumaça para evaporar o etanol por pelo menos 2 h à temperatura ambiente. Verifique as amostras quanto ao odor de etanol: se for detectável, as amostras não estão prontas e devem ser deixadas para secar até que o odor de etanol se dissipe.
8. Limpe todos os materiais e descarte resíduos. Desligue a centrífuga e o bloco de calor. Descarte todos os resíduos sólidos e líquidos de acordo com as diretrizes de saúde e segurança ambiental da instituição designada.
9. Preparar slides de microscópio para identificação de pólen; rotulá-los legivelmente. Rotule um slide de microscópio de vidro limpo adequadamente para cada grupo/amostra de cor que será montado. Enquanto inspeciona visualmente o tubo, mexa a amostra com um palito limpo para 10-15 s, e certifique-se de que o conteúdo do tubo esteja completamente misturado.
   NOTA: A preparação do slide pode ser feita no banco do laboratório. Descarte o palito em resíduos não terzardes. Use um palito novo e limpo para cada amostra.
   1. Usando uma pipeta de transferência de plástico descartável limpa, remova 1 gota de resíduo de pólen de um tubo e coloque-a no centro de seu slide de microscópio rotulado. Deixe a gota se espalhar ligeiramente. Coloque uma mancha de cobertura limpa sobre a gota no slide.
   2. Depois que o slide secar, sele a mancha de cobertura no slide com esmalte claro. Coloque uma pequena gota de polonês em cada canto da mancha de cobertura, e pinte uma borda de polimento ao redor do perímetro do deslizamento de tampa onde ele encontra o slide. Deixe o esmalte secar completamente, e pinte uma segunda camada de polimento ao redor do perímetro da mancha de cobertura.

Um estudo anterior relatou a avaliação da diversidade de pólen coletado pelas abelhas nas seguintes culturas agrícolas: amêndoa, cereja, mirtilo highbush, cenoura híbrida e meadowfoam¹⁴. Utilizando os métodos descritos, foi coletado pólen corbicular, classificado por cor, e as fontes vegetais de cada grupo de cor de pelotização identificadas para avaliar a diversidade de pólen. Armadilhas de pólen de montagem inferior foram instaladas em colônias em vários locais para cada cultura (Figura 1A). A quantidade de pólen coletada em cada local foi suficiente para cumprir os requisitos de peso amostral dos métodos de triagem de cores e análise de acetálise. Cada amostra de coleta de pólen tinha múltiplos grupos de cores distinguíveis (Figura 2 e Figura 3). Em algumas amostras, os grupos de cores de pólen continham apenas 4-5 pelotas; no entanto, a maioria dos grupos tinha significativamente mais do que isso e, assim, serviu como seu próprio grupo de cores rotulado para acetólise (Figura 4 e Figura 5). Após acetolise (Figura 6), a microscopia luminosa de luz foi utilizada para identificar efetivamente cada grupo de cor à sua menor classificação taxonômica possível, confirmando as características morfológicas com as amostras de voucher coletadas da área ao redor de cada local de estudo (Figura 7).

Figura 1: Armadilhas de pólen instaladas em uma colônia de abelhas de mel para coletar pólen corbicular. (A) Armadilhas de suporte inferior colocadas acima da tábua inferior da colmeia e diretamente acima da caixa colmeia mais baixa. Outros estilos de armadilha de pólen incluem (B) suporte frontal e (C) armadilhas de montagem de entrada de buracos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Mecanismo de trapping e bandeja de coleta de armadilha de pólen. Os forasteiros de pólen que retornam devem espremer através do mecanismo de captura de malha antes de atingir sua colmeia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Bandeja de coleta de armadilha de pólen. Pólen corbicular é raspado das pernas de intrusos de pólen retornando pela armadilha de pólen e cai na bandeja de coleta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Classificando uma amostra de pólen corbicular em grupos de cores. O pólen corbicular pode ser seco e pesado depois de classificado em grupos de cores para relatar proporções de diferentes pelotas de cor coletadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Quatro grupos de pelotas de pólen classificadas por cor usando o guia de cor Pantone. Os grupos de cores são rotulados como (A) cinza, Pantone 5855C, (B) marrom, Pantone 7557C, (C) amarelo, Pantone 458C e (D) marrom claro, Pantone 3547C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Configuração do equipamento de acetólise dentro do capô da fumaça. O bloco de calor, reagentes, resíduos de solventes e recipientes de resíduos ácidos, bicos rotulados, pipeta, pontas de pipeta, bastões de agitação e tubos de microcentrifuuge situados dentro do capô de fumaça. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: Micrografia de grãos de pólen manchados e acetolisados. Muitas facetas de mostarda acetolisada (Brassicaceae) grãos de pólen a 40x de ampliação. Barra de escala = 50.398 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O pólen coletado nos locais de cultivo de amêndoas apresentou diversidade de pólen relativamente menor do que o pólen coletado de outras culturas, com uma média de 3,0 ± 0,5 cores de pelotas e 3,2 ± 1,2 taxa vegetal por local (Tabela 2)¹⁴. Os quatro sistemas de corte restantes apresentaram maiores níveis de diversidade de pólen, com média de 6,0 ± 2,0 cores de pelotas e 8,0 ± 1,5 taxa vegetal por local em cereja, 8,8 ± 1,4 cores de pelotas e 13,5 ± taxa vegetal por local em blueberry highbush, 7,0 ± 1,0 cores de pelotas e 11,0 ± 0,0 taxa de planta por local em cenoura híbrida, e 10,0 ± 0,0 cores de pelotas e 13,0 ± planta de 1,5 taxa por local na meadowfoam¹⁴.

Tabela 2: Diversidade de pólen corbicular coletado de abelhas de mel em cinco sistemas de cultivo. As métricas de diversidade incluem o número médio de cores de pelotas (± SE), o número médio de taxa vegetal (± SE) e a taxa total identificada. Esta tabela foi modificada a partir de¹⁴. Abreviação: SE = erro padrão.

Diferentes estilos de armadilha de pólen têm suas próprias vantagens e consequências. Os benefícios e limitações de quatro estilos de armadilha comumente usados, (1) suporte frontal, (2) suporte inferior, (3) auger-hole e (4) armadilhas de pólen de montagem superior são discutidos abaixo. Armadilhas de montagem frontal são o estilo mais versátil (Figura 1B). A instalação é rápida e fácil; pode ser feito sem levantar caixas de colmeia, e essas armadilhas podem caber em qualquer estilo Langstroth de equipamento de colmeia. Como a bandeja de coleta fica em frente à colônia, ela recolhe detritos mínimos da colônia. No entanto, a bandeja de coleta também está mais exposta a elementos externos-umidade da irrigação do campo, tempo chuvoso ou úmido, ou orvalho pode entrar em contato com o pólen através da bandeja de coleta, potencialmente tornando o pólen inutilizável se as pelotas ficarem muito saturadas para se separarem. O risco de saturação do pólen pode ser reduzido evitando armadilhas durante eventos previstos de chuva ou alta umidade. Colocar um tapete de borracha sob a armadilha e material de cobertura extra (por exemplo, sentir cobertura) em cima da armadilha de pólen também pode proteger a bandeja de coleta do tempo.

Armadilhas de montagem inferior foram usadas para coletar pólen para os dados neste artigo (Figura 1A). Eles não são tão convenientes de instalar porque devem ser colocados sob o ninho de ninhadas da colônia. A instalação é demorada e resulta em um alto volume de detritos caindo na armadilha da colônia, como partes de abelhas e pequenos pedaços de cera. O piso da bandeja de coleta para a maioria das armadilhas de montagem inferior fabricada é feito de malha fina, que permite ventilação adequada para proteger o pólen coletado da umidade. Armadilhas de pólen de buracos de auger ajudam a minimizar a desorientação dos forasteiros se eles usam principalmente os orifícios auger como entradas de colmeia em vez da entrada feita pela placa inferior da colmeia (Figura 1C). Como a bandeja de coleta para armadilhas de pólen de buraco é muito pequena, ela deve ser esvaziada com frequência para evitar transbordamento da bandeja de coleta. Dada a sua colocação superior em uma colmeia, a armadilha de pólen de montagem superior é o estilo de armadilha mais fácil de instalar e remover, e a amostra de pólen coletada está livre de detritos de colmeia. No entanto, este estilo de armadilha é extrassensível aos equipamentos de colmeia danificados, pois a bandeja de coleta seria exposta à umidade se a tampa, a tampa interna e a caixa de colmeia superior não estiverem devidamente seladas.

Os protocolos aqui descritos pedem a seleção de colônias com grandes populações adultas e larvas (etapa 1.2). Este método de seleção destina-se a produzir grandes quantidades de pólen preso dessas colônias. Colônias com populações de forrageamento substanciais podem sofrer congestionamento severo na entrada após a instalação da armadilha. Selecionar uma grande entrada de colmeia aliviará o congestionamento. Grandes populações forrageiras também podem coletar grandes quantidades de pólen que podem exceder os limites da bandeja de coleta. Use bandejas de coleta volumosas, como visto com a maioria dos estilos de armadilha de montagem inferior ou superior, e bandejas vazias com frequência para acomodar grandes quantidades de pólen preso. Se o objetivo desejado da pesquisa é avaliar as quantidades de pólen coletadas pelas colônias em um apiário, selecione colônias representativas em vez de otimizar as populações adultas e larvas para seleção. Todos os estilos de armadilhas de pólen bloqueiam a entrada da colmeia e criam uma nova entrada que difere espacialmente da entrada^{original 16}. As armadilhas de pólen geralmente não conseguem coletar pólen quando os forasteiros são incapazes de reorientar para a nova entrada da armadilha de pólen após a instalação. Esses forasteiros prontamente se afastam para colmeias vizinhas, potencialmente contaminando outras amostras de coleta de pólen se entrarem em outra colmeia com uma armadilha de pólen. Assim, os forasteiros devem receber pelo menos 24 horas para se adaptarem à nova entrada, mantendo o mecanismo de captura desligado após a instalação. Selecionar colônias com poucas ou nenhuma entrada adicional de colmeia também reduz a confusão ao orientar para a nova entrada da armadilha do pólen.

Entradas adicionais de colmeia (por exemplo, buracos e tampas deformadas) devem ser seladas, mas o risco de intrusos à deriva para colmeias vizinhas aumentará com essas entradas presentes no início da instalação da armadilha. Os forasteiros também facilmente irão para outras entradas de colmeias se uma armadilha de pólen for instalada apenas em uma única colmeia em um aglomerado de colmeias paletizadas. Os forasteiros são menos propensos a deriva se todas as colmeias que estão enfrentando a mesma direção no palete tiverem armadilhas instaladas. Armadilhas de pólen de alto nível podem representar um risco maior de deriva de abelhas devido à distância substancial entre a entrada da armadilha do pólen e a entrada original da colmeia. Para este estudo, foram instaladas armadilhas de pólen em várias colônias de abelhas de mel em cada local experimental para explicar a variação da quantidade de pólen e da composição tributária entre cada colônia de abelhas de mel. Assim, as armadilhas de pólen devem ser instaladas em várias colônias para obter coleções robustas de pólen da paisagem, pois a coleta de pólen pode variar amplamente entre colônias baseadas no tipo de espécies vegetais e quantidade total coletada^12,13. Cada amostra de pólen teve um período de coleta de 7 dias. Em estudos futuros, a coleta de pólen em dois ou três intervalos consecutivos de 72h aumentará a precisão da estimativa de forragem de pólen⁴⁰.

Como há um alto grau de flutuação temporal na coleta de pólen, a precisão da estimativa de pólen poderia ser aumentada repetindo o processo de coleta de pólen nos períodos iniciais, de pico e de floração tardia dos sistemas de cultivo^{direcionados 24,27,39}. O pólen deve ser coletado em vários locais, embora o mesmo sistema de cultivo ou tipo de paisagem, devido à variação prevista na quantidade e tipo de espécies vegetais entre os locais apiários 14,27,33,43. A captura de pólen a longo prazo pode ser prejudicial para colônias de abelhas de mel. Os impactos potenciais incluem redução da criação de ninhadas, encurtamento do período de crescimento larval e canibalismo de ovos e larvas jovens nas colmeias 19,44,45,46. Períodos mais longos de captura de pólen, como toda a estação de cultivo, podem piorar os efeitos nocivos na criação de ninhadas em colônias. A captura de pólen também pode causar uma redução na produção de mel e um aumento no nível de umidade do mel armazenado¹³. Armadilhas rotativas de pólen entre colônias em um apiário ao monitorar continuamente uma paisagem ou sistema de cultivo poderia mitigar danos às colônias usadas para a captura de pólen. Engajar armadilhas de pólen a cada duas semanas reduzirá os impactos prejudiciais, particularmente a perda na produção de mel, se prender o pólen nas mesmas colônias durante um período de^{tempo 13}.

Além disso, as armadilhas de pólen são preferencialmente colocadas em colônias fortes. Ocasionalmente, as armadilhas de pólen podem se envolver sem querer. Isso pode ser evitado trancando o mecanismo da armadilha do pólen quando a coleta de armadilhas de pólen não for desejada. As armadilhas de pólen não removem todo o pólen corbicular dos forasteiros das abelhas. A eficiência da captura depende do tipo de armadilha, tamanho da pelota de pólen, tamanho do corpo das abelhas, a hora do dia e as condições climáticas. Assim, a coleta de pólen corbicular não é consistente ao usar armadilhas de pólen para diferentes espécies vegetais e períodos^{de coleta 25,26}. Pelotas menores de pólen de plantas como Eucalyptus spp. e Tamarix spp. são menos propensas a serem capturadas por armadilhas de pólen²⁷. Notavelmente, nenhum pólen de mirtilo highbush (Vaccinium corymbosum L.) foi encontrado nos locais de coleta de mirtilo highbush neste estudo, o que suporta evidências anteriores de que as pelotas de pólen de mirtilo highbush são muito pequenas para a coleta de armadilhas de pólen⁴⁷. Em contraste, o pólen proveniente do dente-de-leão (Taraxacum officinale F.H. Wigg) foi encontrado em todos os sistemas de cultivo neste estudo. Pelotas de pólen de algumas espécies vegetais também podem ser muito maiores do que outras, como Taraxacum spp., e poderiam ser super-representadas na análise de coleções de pólen de armadilhas de pólen²⁷. Capturar os forasteiros individuais de pólen e remover manualmente seu pólen corbicular aumentará a precisão de uma avaliação de fonte de pólen, mas é muito demorado e intensivo em recursos em comparação com o uso de armadilhas de pólen (Tabela 1). Classificar pelotas de pólen em grupos de cores é relativamente direto, embora seja demorado. A menos que haja um objetivo ou objetivo específico da pesquisa, a quantidade de pelotas de pólen deve ser limitada a 10 g ou menos (para qualquer amostra) para classificação em grupos de cores. A classificação de amostras inteiras que contenham quantidades maiores do que esse montante aumentará drasticamente o tempo necessário para concluir a análise. É, no entanto, crucial que uma amostra de pólen seja muito bem misturada antes que uma subsample para classificação de cores seja retirada dela. A não mistura da amostra original pode resultar em uma subsample que não é representativa do todo, o que deve ser evitado.

Se o recipiente de amostra original não contiver espaço livre suficiente para permitir a mistura completa de pelotas de pólen, colocar toda a amostra em um grande saco plástico ou um pequeno saco de papel deve ser suficiente, mesmo para amostras grandes. Plástico duro, recipientes tampados também funcionarão. A mistura da amostra deve ser feita suavemente, de modo que as pelotas de pólen não sejam esmagadas ou destruídas de outra forma. Viés não intencional poderia subconscientemente persuadir alguém a colher "as pelotas bonitas roxas", por exemplo, ao remover uma subsample do todo. Portanto, a composição de cores da amostra deve ser obscurecida da vista enquanto tira uma subsampleção. Desta forma, obter uma subsample que é verdadeiramente representativa do todo é mais provável. No entanto, este método de subsumagem pode não selecionar pelotas de pólen que estão em baixa abundância na amostra. Portanto, se identificar cada imposto de planta individual representado na amostra é um objetivo de pesquisa, a coleta de uma subsamplega não será apropriada; toda a amostra deve ser analisada. Assim, as pelotas devem ser classificadas em uma placa de vidro Petri. Uma vez concluída a classificação, páginas apropriadas do guia de cores Pantone podem ser colocadas sob o prato para facilitar a correspondência de cores entre o guia e o pólen classificado. Um exemplo disso é ilustrado na Figura 5.

Ao prender pólen de colônias de abelhas de mel colocadas em culturas para polinização, não devem ser utilizados mais de dez grupos de cores totais: nove cores individuais e um grupo de cores "diversos" composto pelas cores minoritárias na amostra. Colocar um limite razoável no número máximo de grupos de cores em que uma amostra pode ser dividida impede que o pesquisador fique atolado, separando infinitamente pelotas em um número cada vez maior de grupos extremamente específicos, que, quando a classificação é completa, pode não conter individualmente quantidades suficientes para acetolise. Se a captura de colônias que são provavelmente forrageando de uma variedade muito diversificada de espécies vegetais, mais grupos de cores podem ser necessários, e os protocolos devem ser otimizados para refletir essa exigência. O presente estudo concentrou-se nas amostras de pólen coletadas das colônias de abelhas polinizando as culturas, e vários taxas foram comumente encontradas em um grupo de cores, semelhante aos estudos anteriores 29,30,31.

A acetálise dissolve os lipídios, proteínas e detritos orgânicos da superfície dos grãos de pólen, revelando os distintos caracteres da exina, para que os grãos possam ser manchados e identificados mais facilmente. É uma metodologia antiga e comum utilizada em muitos tipos de pesquisa de pólen³⁷. As etapas gerais são padronizadas; eles variam pouco de protocolo para protocolo. No entanto, as especificidades das velocidades e tempos de centrifugação, temperatura e duração da incubação, volumes de reagentes orientados por quantidade de pólen e até mesmo o método de remoção de supernacantes (decantação vs pipetação) podem precisar ser otimizados experimentalmente de acordo com as metas de pesquisa e, em certa medida, os tipos de pólen provavelmente^{serão encontrados 48}. De fato, a acetálise pode remover caracteres diagnósticos importantes do pólen de alguns impostos, como Malvaceae e Orchidaceae³⁸. Portanto, nem todo pólen é favorável aos métodos padrão de acetálise. Como dito acima, esses métodos foram otimizados neste estudo com o objetivo de identificar fontes dominantes de tributação vegetal de pólen coletadas por abelhas de mel polinizadora. Detalhes a serem considerados se a quantificação precisa dos grãos de pólen faz parte do estudo, não foram abordados neste artigo.

O uso de solventes e ácidos requer planejamento cuidadoso, equipamentos de proteção individual (EPI) adequados e descarte responsável de resíduos (Figura 6). É fundamental que os pesquisadores determinem a maneira correta de armazenar reagentes e descartar resíduos antes de iniciar qualquer parte da acetálise. Neste laboratório, luvas de butil são usadas durante qualquer parte do processo que envolve ácido sulfúrico e até ácido acético glacial, pois possuem classificações de degradação e permeação muito melhores para ambos os ácidos do que luvas de nitrito, ao mesmo tempo em que não comprometem a destreza⁴⁹. Seria prudente consultar as diretrizes de segurança da respectiva instituição para recomendações sobre luvas apropriadas e outros EPI⁴⁹. A adição de ácido acético glacial antes da etapa de acetrólise ajuda a remover qualquer umidade residual na amostra e prepara-a para a importante reação de acetrólise. A mistura de ácido acético-ácido sulfúrico glacial no passo da acetólise pode reagir violentamente com a água, e é por isso que é importante que todos os vidros e suprimentos estejam completamente secos, e que toda a umidade seja removida da amostra antes da acetólise. A adição pós-acetólise do ácido acético glacial dilui e neutraliza a mistura de acetrólise.

O etanol e o ácido acético glacial, em particular, podem dissolver a tinta dos rótulos dos tubos de microcentrifuuge, se esses reagentes escorrerem na parte externa do tubo, mesmo com canetas resistentes a solventes. Verifique as etiquetas do tubo com frequência durante todo o processo para ter certeza de que elas ainda são legíveis. Se for viável logisticamente, considere usar etiquetas impressas pela LaserJet como uma salvaguarda contra essa possibilidade. A maneira como os supernacantes são decantados influenciará se os reagentes driblam o lado de fora dos tubos de microcentrifuuagem. É importante decantar o supernaente com uma mão confiante e suave, que vem com a prática. Deve-se tomar cuidado para evitar a perda de amostras de pólen do tubo centrífuga durante a decantação. Decantar muito rápido corre o risco de perder parte ou todo o resíduo de pólen; decantar muito lentamente pode resultar na sobrenação correndo pelo tubo. Embora uma temperatura de incubação de 100 °C seja comumente recomendada, o pólen poderia facilmente se tornar "cozido demais" a essa temperatura nas quantidades utilizadas neste estudo (0,25 g), particularmente se incubado por durações ligeiramente mais longas²⁹. Na verdade, mesmo a 80 °C, os grãos de pólen podem estourar ou de outra forma ser danificados se deixados na mistura de acetálise por muito tempo. A temperatura e duração da incubação devem ser cuidadosamente determinadas para evitar destruir os grãos de pólen na amostra.

A coloração do pólen aumenta a definição e o contraste das características exina, facilitando a fotografia e identificação (Figura 7). Cinco gotas (de uma pipeta de transferência de plástico) de 1% Safranin O efetivamente manchado 0,25 g de pólen. No entanto, diferentes pólens mancham de forma diferente. Se os grãos de pólen estiverem manchados muito levemente ou muito fortemente, a identificação pode ser difícil. Quando possível, o volume da solução de manchas necessária para manchar adequadamente as espécies de pólen que se espera encontrar no estudo deve ser validado antes de iniciar o processamento das amostras experimentais. No entanto, se uma das amostras experimentais não estiver devidamente manchada, ela pode ser corrigida. Para clarear uma amostra de pólen que está manchada muito fortemente, enxágue a amostra com água e, em seguida, etanol. Se o pólen não estiver bem manchado o suficiente para ver características distintas, algumas gotas adicionais de mancha podem ser adicionadas. A mancha dessas amostras deve ser verificada antes de adicionar glicerina. Da mesma forma, alguma tentativa e erro podem ser necessários para determinar o volume ideal de glicerina para os resíduos de pólen. Quinze gotas de glicerina protegeram adequadamente as amostras neste estudo desde a secagem, ao mesmo tempo em que diluiram o resíduo de pólen até uma concentração ideal para identificação a jusante via microscopia leve. Outras quantidades de resíduo de pólen podem exigir mais ou menos glicerina para evitar a dessecação e facilitar a montagem.

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecemos à Dra. Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) por ajudar na triagem de cores e análise de acetálise. Esta pesquisa foi apoiada por fundos de pesquisa fornecidos à R.R.S. pela Associação de Apicultores do Estado de Oregon.