Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Vi beskriver metoder för att samla in korbikulärt pollen från honungsbin samt protokoll för färgsortering, acetolys och mikroskopberedning av pollen för taxonomisk identifiering. Dessutom presenterar vi pelletsfärg och taxonomisk mångfald av korbikulär pollen som samlats in från fem odlingssystem med pollenfällor.
Forskare samlar ofta in och analyserar korbikulär pollen från honungsbin för att identifiera de växtkällor som de födosöker efter pollen eller för att uppskatta exponering av bekämpningsmedel hos bin via pollen. Häri beskrivs en effektiv pollenfångningsmetod för att samla korbikulär pollen från honungsbin som återvänder till sina bikupor. Denna insamlingsmetod resulterar i stora mängder korbikulär pollen som kan användas för forskningsändamål. Honungsbin samlar pollen från många växtarter, men besöker vanligtvis en art under varje insamlingsresa. Därför representerar varje korbikulär pollenpellets övervägande en växtart, och varje pollenpellets kan beskrivas med färg. Detta möjliggör sortering av prover av korbikulär pollen efter färg för att segregera växtkällor. Forskare kan ytterligare klassificera korbikulär pollen genom att analysera morfologin hos acetolyserade pollenkorn för taxonomisk identifiering. Dessa metoder används ofta i studier relaterade till pollinatorer som pollineringseffektivitet, pollinatörens födosöksdynamik, kostkvalitet och mångfald. Detaljerade metoder presenteras för att samla korbikulärt pollen med hjälp av pollenfällor, sortera pollen efter färg och acetolysera pollenkorn. Dessutom presenteras resultat som rör frekvensen av pelletsfärger och taxa av korbikulär pollen som samlats in från honungsbin i fem olika odlingssystem.
Det västra honungsbiet (Apis mellifera L.) är en viktig pollinator av många jordbruksgrödor som är beroende av bi-pollinering1. I mer än ett decennium har betydande förluster av honungsbikolonier rapporterats 2,3,4,5,6,7,8,9. Flera faktorer - inklusive parasiter och sjukdomar, dålig näring och bekämpningsmedel - har varit inblandade i dessa koloniminskningar10. Dålig näring kan hänföras till intensifiering av jordbruket och förlust av födosökshabitat11. Det är absolut nödvändigt att förstå de blommiga resurser som används av bin i olika landskap för att förbättra binäringen och hjälpa till med biskyddsinsatser. Pollen är den primära källan till protein, lipider, vitaminer och mineraler för bin och har använts i många jordbruks- och ekologiska studier för att förstå födosökspreferenser på koloninivå hos honungsbin, utvärdera effekterna av pollenfångst på honungsbikolonier och bestämma exponering för bekämpningsmedel för bin12,13,14.
Honungsbin samlar pollen från blommor, packar pollen i pellets på deras corbicula - en tibial pollenkorg på bakbenet - och återvänder till kolonin för lagring. Korbikulär pollen kan avlägsnas från födosökare genom att fånga dem vid bikupans ingång eller på blommor, kyla dem kort för att immobilisera dem och sedan ta bort pollenpellets från bakbenen med pincett. Den mödosamma processen att handuppsamla korbikulärt pollen från individuellt fångade födosökare är långsam och ineffektiv om man behöver en betydande mängd pollen. En enklare och effektivare metod för att samla in stora mängder pollen är att fånga korbikulära pollenpellets från honungsbin vid bikupans ingångar. Pollenfällor är utformade för att lossa korbikulärt pollen från benen på de återvändande pollenfödarna när de kommer in i bikupan15. Födosökarna måste pressa genom näthål som är dimensionerade för att smalt tillåta passage av en honungsbiarbetarkropp.
När honungsbiet passerar genom ett av dessa hål skrapas de större pollenpelletsen av hennes ben och faller ner i en uppsamlingsbricka16. Studier har visat att pollenfångst stimulerar födosökare att samla mer pollen, vilket ökar pollineringseffektiviteten hos de omgivande grödorna och vegetationen17,18,19,20. Polleninsamlingsmetoder kan också användas för att förstå det foder som används av honungsbin i landskapet som det första steget för att bestämma kvantitet, kvalitet och taxa för blommande växtarter. Effektiva pollenfångningsmetoder underlättar således både pollinering och honungsbinäringsforskning. En jämförelse av dessa pollenuppsamlingsmetoder illustreras i tabell 1. Pollenfödosöksbeteendet kommer att förändras baserat på kolonins behov av lagrat pollen i förhållande till dess ägg- och larvpopulationsnivåer21,22. Eftersom dessa förändringar inkluderar varierande insamlingsintensitet förväntas ofta stora variationer i pollenmängd mellan kolonier på samma plats och mellan olika platser i samma odlingssystem eller landskapstyp23,24. Att öka antalet kolonier och platser för att fånga pollen hjälper till att tillgodose denna variation.
Pollenfällor varierar i effektivitet25,26. Storleken på pollenpellets som samlas in av honungsbin varierar mellan olika växtarter och kan förändras beroende på nivåerna av pollenförråd i kolonin27,28. Detta innebär en risk för att mindre pollenpellets blir underrepresenterade och större pellets överrepresenterade i prover som samlas in via pollenfällor. Vuxna bin varierar i kroppsstorlek, vilket också kan påverka representationen av pollen som samlas in i fällor. Det finns också växtarter som huvudsakligen producerar nektar som inte kommer att upptäckas om man bara bedömer insamlat pollen i vissa landskap. Fångsteffektiviteten påverkas också av födosöksdrift och desorientering, vilket påverkas av pollenfällans typ och bikupans skick. Detta problem kan mildras genom att använda tekniker som anges i detta dokument. Utredare kan överväga ytterligare forskningstekniker, såsom att räkna blomsterbesök av födosökare, för att komplettera resultaten av födosökspreferenser på koloninivå. En användbar metod för att bedöma pollendiversitet är att sortera korbikulär pollen efter färg. Även om honungsbin är generalister för födosökare, uppvisar de också blomtrohet, där de samlar pollen från samma växtart på samma plats under en viss insamlingsresa. Baserat på detta födosöksbeteende antas det att varje given korbikulär pollenpellets huvudsakligen representeras av en enda växtart 27,29,30,31. Därför kan forskare beskriva pollendiversitet genom att sortera korbikulär pollen efter pelletsfärg och rapportera det totala antalet upptäckta färger eller andelen av den totala som representeras av varje färggrupp 12,32,33,34. Detta kan åstadkommas genom att mäta massan eller pelletsantalet för varje färggrupp. Mätning av pelletsantalet för varje färggrupp föreslås om det finns kända eller misstänkta systematiska skillnader i vikten av pellets från olika taxa. Systematiska skillnader kan orsakas av pelletsstorlek eller mängden nektar som foderhandlare tillför pollen när de bildar en pellets.
Färgsortering är en tidseffektiv och enkel process, men kanske inte har acceptabel noggrannhet för vissa pollineringsforskningsstudier eftersom olika växttaxa kan ha liknande pollenpelletsfärger35,36. Dessutom finns det en logistisk gräns för antalet distinkta färggrupper som pollenpellets kan separeras i. Således kan separationen av varje enskild växttaxonpollen i sin egen distinkta pelletsfärggrupp inte alltid vara möjlig i pollineringsstudier. Morfologisk karakterisering av pollenkorn via ljusmikroskopi kompletterar ofta färgseparation av pellets genom att särskilja pollen från två eller flera taxa i pellets av samma färggrupp. Även om det är vanligt att hitta pollenkorn med flera taxa i en given pollenpelletsfärggrupp, utgör enskilda pollenpellets som samlas in av ett honungsbi i allmänhet ett dominerande taxon, eventuellt med andra taxa i mindre mängder. Således är det vanligt att anta taxonomisk trohet i korbikulära pollenpellets av honungsbin. Pollenpellets från andra pollinatörer som inte uppvisar blomtrohetsbeteende, såsom humlor, innehåller ofta många växtarter och kanske inte har ett dominerande taxon. I fall där kvantitativa uppskattningar av taxaproportioner i polyflorala pollenpellets önskas krävs dessutom mikroskopiska metoder som inkluderar acetolys för korrekt analys.
Bedömning av morfologiska egenskaper hos acetolyserade pollenkorn är den vanligaste metoden för taxonomisk identifiering16. Acetolysproceduren tar bort pollenkornets protoplasma för att exponera diagnostiska egenskaper som kan observeras under ljusmikroskopi37,38. Med hjälp av denna metod kan forskare rapportera olika taxa, frekvens av taxa som finns i specifika beskärningssystem och dominerande taxa av pelletsfärger33,36. Acetolys är den bästa analytiska tekniken för att avslöja pollenmorfologi28. Vissa acetolyserade pollenkorn, såsom många Rosaceae-typer, kan dock inte identifieras till släkt- eller artnivå genom acetolys och ljusmikroskopi ensam. Forskare överväger svepelektronmikroskopi eller metabarkodning som alternativa metoder för att uppnå identifiering på genus- eller artnivå. Dessa alternativa metoder ger dock endast kvalitativ taxonidentifiering och misslyckas med att uppskatta proportionerna av olika pollenkorntaxa i polyflorala pollenpellets36,39. Dessutom är kostnaden och nödvändig expertis betydligt högre för dessa metoder. En jämförelse av dessa identifieringsmetoder illustreras i tabell 1.
Metoder | Tid | Utgift | Resolution | Expertis |
Pollen Samling | ||||
Pollen fångst | Låg | Moderat | Variabel | Moderat |
Pollen födosökare insamling | Hög | Moderat | Hög | Låg |
Pollen identifiering | ||||
Visuellt objekt (endast färgsortering) | Moderat | Låg | Låg | Låg |
Acetolys | Moderat | Moderat | Moderat | Moderat |
Svepelektronmikroskopi | Hög | Hög | Hög | Hög |
Metabarkodning | Variabel | Hög | Hög | Hög |
Tabell 1: Jämförelse av olika metoder för insamling och identifiering av pollen baserat på tid, kostnad, upplösning och expertis. Visuella metoder (endast färgsortering) rapporterar det totala antalet upptäckta färger eller andelen av det totala antalet som representeras av varje färggrupp som ett mått för att bestämma pollenkällor, men ger inte taxonidentifiering.
Den information som finns tillgänglig om fångst och sortering av pollen och acetolyserande pollenkorn är mångsidig och ofta spridd över flera källor, varierande för forskare inom olika områden. Denna uppsats ger detaljerade insikter i olika typer av pollenfällor som kan användas av både forskare och biodlare för att effektivt samla in stora volymer korbikulär pollen. Det finns också protokoll för beredning av pollenprover - genom acetolys, färgning och glidmontering - för identifiering av växttaxa. De metoder som beskrivs här är omfattande och fungerar som en unik resurs för att identifiera dominerande växtarter som honungsbin födosöker i ett visst landskap, särskilt i odlingssystem. Resultat baserade på dessa metoder från en tidigare studie har presenterats och dokumenterar mångfalden av pollenpelletsfärger och växttaxa från korbikulär pollen som samlats in av honungsbin i fem odlingssystem14.
1. Samla korbikulär pollen från honungsbikolonier med pollenfällor
2. Pollenpelletsfärgsortering för identifiering och kvantitetsbedömning av pollenkällor nedströms
3. Förberedelse för acetolys
4. Acetolys
En tidigare studie rapporterade bedömningen av mångfalden av pollen som samlats in av honungsbin i följande jordbruksgrödor: mandel, körsbär, highbush blåbär, hybrid morot och ängsskum14. Med hjälp av de beskrivna metoderna samlades korbikulär pollen, sorterad efter färg, och växtkällorna för varje pelletsfärggrupp identifierades för att bedöma pollendiversiteten. Bottenmonterade pollenfällor installerades på kolonier på flera platser för varje gröda (figur 1A). Mängden pollen som samlades in från varje plats var tillräcklig för att uppfylla provviktskraven för färgsorterings- och acetolysanalysmetoderna. Varje pollenuppsamlingsprov hade flera urskiljbara färggrupper (figur 2 och figur 3). I vissa prover innehöll pollenfärggrupper så få som 4-5 pellets; de flesta grupper hade dock betydligt mer än så och fungerade därmed som sin egen märkta färggrupp för acetolys (figur 4 och figur 5). Efter acetolys (figur 6) användes ljusfältsljusmikroskopi för att effektivt identifiera varje färggrupp till lägsta möjliga taxonomiska rang genom att bekräfta de morfologiska egenskaperna med de hos kupongprover som samlats in från området kring varje studieplats (figur 7).
Figur 1: Pollenfällor installerade på en honungsbikoloni för att samla korbikulär pollen . (A) Bottenmonterade fällor placerade ovanför bikupans bottenbräda och direkt ovanför den lägsta bikupan. Andra pollenfällor inkluderar (B) frontfäste och (C) skruvhålsfästfällor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fångstmekanism och uppsamlingsbricka av pollenfälla. Återvändande pollenförädlare måste pressa igenom nätfångstmekanismen innan de når sin bikupa. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Uppsamlingsbricka med pollenfälla. Korbikulär pollen skrapas av benen på återvändande pollenförädlare av pollenfällan och faller i uppsamlingsbrickan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Sortera ett prov av korbikulär pollen i färggrupper. Korbikulär pollen kan torkas och vägas efter att den har sorterats i färggrupper för att rapportera proportioner av olika färgpellets som samlats in. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Fyra grupper av pollenpellets sorterade efter färg med hjälp av Pantone-färgguiden. Färggrupperna är märkta som (A) grå, Pantone 5855C, (B) brun, Pantone 7557C, (C) gul, Pantone 458C och (D) ljusbrun, Pantone 3547C. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Inställning av acetolysutrustning inuti dragskåpet. Värmeblocket, reagenser, lösningsmedelsavfall och syraavfallsbehållare, märkta bägare, pipett, pipettspetsar, omrörningspinnar och mikrocentrifugrör som ligger inuti dragskåpet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Mikrograf av färgade, acetolyserade pollenkorn. Många fasetter av acetolyserad senap (Brassicaceae) pollenkorn med 40x förstoring. Skalstreck = 50,398 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Pollen som samlades in från mandelgrödor hade relativt lägre pollendiversitet än pollen som samlats in från andra grödor, med i genomsnitt 3,0 ± 0,5 pelletsfärger och 3,2 ± 1,2 växttaxa per plats (tabell 2)14. De återstående fyra odlingssystemen hade högre pollendiversitetsnivåer med i genomsnitt 6,0 ± 2,0 pelletsfärger och 8,0 ± 1,5 växttaxa per plats i körsbär, 8,8 ± 1,4 pelletsfärger och 13,5 ± 2,0 växttaxa per plats i highbush blåbär, 7,0 ± 1,0 pelletsfärger och 11,0 ± 0,0 växttaxa per plats i hybrid morot och 10,0 ± 0,0 pelletsfärger och 13,0 ± 1,5 växttaxa per plats i ängsskum14.
Gröda | Genomsnittligt antal pollenpelletsfärger/plats (SE) | Genomsnittligt antal växttaxa/växtområden (SE) | Totalt antal identifierade taxa | ||
Familj | Släkte | Art | |||
Mandel | 3.0 (0.5) | 3.2 (1.2) | 4 | 3 | 4 |
Blåbär | 8.8 (1.4) | 13.5 (2.0) | 5 | 10 | 13 |
Morot | 7.0 (1.0) | 11.0 (0.0) | 3 | 5 | 6 |
Körsbär | 6.0 (2.0) | 8.0 (1.5) | 4 | 7 | 5 |
Ängsskum | 10.0 (0.0) | 13.0 (1.5) | 5 | 4 | 14 |
Tabell 2: Mångfald av korbikulärt pollen som samlats in från honungsbin i fem odlingssystem. Mångfaldsmått inkluderar genomsnittligt antal pelletsfärger (± SE), genomsnittligt antal växttaxa (± SE) och totala taxa identifierade. Denna tabell har ändrats från14. Förkortning: SE = standardfel.
Olika pollenfällstilar har sina egna fördelar och konsekvenser. Fördelarna och begränsningarna med fyra vanliga fällstilar, (1) frontmontering, (2) bottenfäste, (3) skruvhål och (4) toppmonterade pollenfällor diskuteras nedan. Fällor med frontmontering är den mest mångsidiga stilen (figur 1B). Installationen är snabb och enkel; det kan göras utan att lyfta bikupalådor, och dessa fällor kan passa på alla Langstroth-stilar av bikupautrustning. Eftersom uppsamlingsbrickan sitter framför kolonin samlar den minimalt med skräp från kolonin. Uppsamlingsbrickan är dock också mer utsatt för yttre element - fukt från fältbevattning, regnigt eller fuktigt väder, eller dagg kan komma i kontakt med pollen genom uppsamlingsbrickan, vilket potentiellt gör pollen oanvändbar om pellets blir för mättade för att separera. Risken för pollenmättnad kan minskas genom att undvika fångst under prognostiserade händelser med regn eller hög luftfuktighet. Att placera en gummimatta under fällan och extra täckmaterial (t.ex. takpapp) ovanpå pollenfällan kan också skydda uppsamlingsbrickan från väder.
Bottenmonterade fällor användes för att samla in pollen för data i detta dokument (figur 1A). De är inte lika praktiska att installera eftersom de måste placeras under kolonins yngelbo. Installationen är tidskrävande och resulterar i att en stor mängd skräp faller i fällan från kolonin, såsom bidelar och små vaxbitar. Golvet i uppsamlingsbrickan för de flesta tillverkade bottenmonterade fällor är gjord av fint nät, vilket möjliggör korrekt ventilation för att skydda det uppsamlade pollenet från fukt. Pollenfällor med skruvhål hjälper till att minimera desorientering av födosökare om de främst använder skruvhål som bikupaingångar istället för ingången från bikupans bottenplatta (figur 1C). Eftersom uppsamlingsbrickan för pollenfällor med skruvhål är mycket liten måste den tömmas ofta för att undvika att uppsamlingsbrickan svämmar över. Med tanke på dess övre placering på en bikupa är den toppmonterade pollenfällan den enklaste fällstilen att installera och ta bort, och det uppsamlade pollenprovet är fritt från bikupeskräp. Denna fällstil är dock extra känslig för skadad bikupautrustning eftersom uppsamlingsbrickan skulle utsättas för fukt om locket, innerlocket och den övre bikupan inte är ordentligt förseglade tillsammans.
De protokoll som beskrivs häri uppmanar till att välja kolonier med stora vuxna och larvpopulationer (steg 1.2). Denna urvalsmetod är avsedd att producera mycket stora mängder fångat pollen från dessa kolonier. Kolonier med betydande födosökspopulationer kan uppleva stor trängsel vid ingången vid fällinstallation. Att välja en stor bikupaingång kommer att lindra trängsel. Stora födosökspopulationer kan också samla in mycket stora mängder pollen som kan överskrida gränserna för uppsamlingsbrickan. Använd omfattande uppsamlingsbrickor, som ses med de flesta botten- eller toppmonterade fällstilar, och töm brickor ofta för att rymma stora mängder fångad pollen. Om det önskade forskningsmålet är att bedöma pollenmängder som samlas in av kolonier i en bigård, välj representativa kolonier istället för att optimera vuxna och larvpopulationer för urval. Alla stilar av pollenfällor blockerar bikupans ingång och skapar en ny ingång som skiljer sig rumsligt från den ursprungliga ingången16. Pollenfällor misslyckas vanligtvis med att samla pollen när födosökare inte kan omorientera till pollenfällans nya ingång vid installationen. Dessa födosökare driver lätt till närliggande nässelfeber, vilket kan korsförorena andra pollenuppsamlingsprover om de går in i en annan bikupa med en pollenfälla. Därför bör födosökare ges minst 24 timmar för att acklimatisera sig till den nya ingången genom att hålla fångstmekanismen urkopplad efter installationen. Att välja kolonier med få eller inga ytterligare ingångar till bikupor minskar också förvirringen när man orienterar sig mot den nya pollenfällans ingång.
Ytterligare ingångar till bikupor (t.ex. hål och skeva lock) bör förseglas, men risken för att födosökare driver till närliggande bikupor kommer att öka med dessa ingångar närvarande i början av fällinstallationen. Foragers kommer också lätt att driva in i andra bikupaingångar om en pollenfälla endast installeras på en enda bikupa i ett kluster av palleterade bikupor. Foragers är mindre benägna att driva om alla nässelfeber som vetter mot samma riktning på pallen har fällor installerade. Toppmonterade pollenfällor kan utgöra en högre risk för bidrift på grund av det stora avståndet mellan pollenfällans ingång och bikupans ursprungliga ingång. För denna studie installerades pollenfällor på flera honungsbikolonier på varje experimentell plats för att ta hänsyn till variationen i pollenkvantitet och taxasammansättning mellan varje honungsbikoloni. Således bör pollenfällor installeras på flera kolonier för att uppnå robusta pollensamlingar från landskapet eftersom pollensamlingen kan variera mycket mellan kolonier baserat på växtartstyp och total insamlad mängd12,13. Varje pollenprov hade en 7-dagars insamlingsperiod. I framtida studier kommer insamling av pollen i två eller tre på varandra följande 72 h-intervall att öka noggrannheten i pollenfoderuppskattning40.
Eftersom det finns en hög grad av tidsmässig fluktuation i pollenuppsamlingen kan pollenuppskattningsnoggrannheten ökas genom att upprepa pollenuppsamlingsprocessen under tidiga, topp- och senblomningsperioder i de riktade odlingssystemen24,27,39. Pollen bör samlas in från flera platser, om än samma odlingssystem eller landskapstyp, på grund av förväntad variation i kvantitet och växtartstyp mellan bigårdsplatser 14,27,33,43. Långvarig pollenfångst kan vara skadlig för honungsbikolonier. Potentiella effekter inkluderar minskad uppfödning av yngel, förkortning av larvtillväxtperioden och kannibalism av ägg och unga larver i bikuporna 19,44,45,46. Längre perioder av pollenfångst, såsom hela växtsäsongen, kan förvärra de skadliga effekterna på uppfödning av yngel i kolonier. Pollenfångst kan också orsaka en minskning av honungsproduktionen och en ökning av fuktnivån hos lagrad honung13. Roterande pollenfällor mellan kolonier i en bigård vid kontinuerlig övervakning av ett landskap eller odlingssystem kan mildra skador på kolonier som används för pollenfångst. Att engagera pollenfällor varannan vecka kommer att minska skadliga effekter, särskilt förlust av honungsproduktion, om man fångar pollen på samma kolonier under en tidsperiod13.
Dessutom placeras pollenfällorna företrädesvis på starka kolonier. Ibland kan pollenfällorna engagera sig oavsiktligt. Detta skulle kunna undvikas genom att låsa pollenfällemekanismen när insamling av pollenfällor inte är önskvärd. Pollenfällor tar inte bort all korbikulär pollen från honungsbi-födosökare. Fångsteffektiviteten beror på fälltyp, pollenpelletsstorlek, bikroppsstorlek, tid på dagen och väderförhållanden. Därför är insamling av korbikulärt pollen inte konsekvent när man använder pollenfällor för olika växtarter och insamlingsperioder25,26. Mindre pollenpellets från växter som Eucalyptus spp. och Tamarix spp. Noterbart är att ingen highbush blåbär (Vaccinium corymbosum L.) pollen hittades från highbush blåbärsuppsamlingsplatserna i denna studie, vilket stöder tidigare bevis för att highbush blåbärspollenpellets är för små för pollenfällsamling47. Däremot hittades pollen från maskros (Taraxacum officinale F.H. Wigg) i varje odlingssystem i denna studie. Pollenpellets av vissa växtarter kan också vara mycket större än andra, såsom Taraxacum spp., och kan möjligen vara överrepresenterade i analysen av pollensamlingar från pollenfällor27. Att fånga enskilda pollenförädlare och manuellt ta bort deras korbikulära pollen kommer att öka noggrannheten i en pollenkällbedömning, men det är mycket tids- och resurskrävande jämfört med att använda pollenfällor (tabell 1). Att sortera pollenpellets i färggrupper är relativt enkelt, även om det är tidskrävande. Om det inte finns ett specifikt forskningsmål eller mål bör mängden pollenpellets begränsas till 10 g eller mindre (för ett visst prov) för sortering i färggrupper. Att sortera hela prover som innehåller större mängder än denna mängd kommer drastiskt att öka den tid som krävs för att slutföra analysen. Det är dock avgörande att ett pollenprov blandas mycket väl innan ett delprov för färgsortering tas från det. Om det ursprungliga provet inte blandas kan det leda till ett delprov som inte är representativt för helheten, vilket bör undvikas.
Om den ursprungliga provbehållaren inte innehåller tillräckligt med ledigt utrymme för att möjliggöra noggrann blandning av pollenpellets, bör det räcka med att placera hela provet i en stor plastpåse eller en liten papperspåse, även för stora prover. Hårdplast, lockbehållare fungerar också. Blandning av provet bör göras försiktigt, så att pollenpellets inte krossas eller på annat sätt förstörs. Oavsiktlig partiskhet kan omedvetet övertala en att skopa ut "de vackra lila pelletsen", till exempel när man tar bort ett delprov från helheten. Därför bör provets färgkomposition döljas från vyn när man skopar ut ett delprov. På detta sätt är det mer troligt att få ett delprov som verkligen är representativt för helheten. Denna subsamplingsmetod kan dock misslyckas med att välja pollenpellets som finns i låg förekomst i provet. Därför, om det är ett forskningsmål att identifiera varje enskild växttaxon som representeras i provet, kommer det inte att vara lämpligt att samla in ett delprov. Hela provet måste analyseras. Därför bör pellets sorteras i en petriskål i glas. När sorteringen är klar kan lämpliga sidor i Pantone-färgguiden placeras under skålen för att underlätta färgmatchning mellan guiden och det sorterade pollenet. Ett exempel på detta illustreras i figur 5.
Vid fångst av pollen från honungsbikolonier placerade i grödor för pollinering bör inte mer än tio totala färggrupper användas: nio enskilda färger och en "diverse" färggrupp bestående av minoritetsfärgerna i provet. Att sätta en rimlig gräns för det maximala antalet färggrupper som ett prov kan delas in i förhindrar att forskaren fastnar genom att oändligt separera pellets i ständigt ökande antal extremt specifika grupper, som, när sorteringen är klar, kanske inte individuellt innehåller tillräckliga mängder för acetolys. Om fångst från kolonier som sannolikt födosöker från ett mycket varierat sortiment av växtarter kan fler färggrupper vara nödvändiga, och protokollen bör optimeras för att återspegla det kravet. Den aktuella studien fokuserade på pollenproverna som samlats in från honungsbikolonier som pollinerade grödor, och flera taxa hittades vanligtvis i en färggrupp, liknande tidigare studier 29,30,31.
Acetolys löser upp lipider, proteiner och organiskt skräp från ytan av pollenkorn och avslöjar exinens särskiljande karaktärer, så att kornen lättare kan färgas och identifieras. Det är en gammal och vanlig metod som används i många typer av pollenforskning37. De allmänna stegen är standardiserade; de varierar lite från protokoll till protokoll. Specifikationerna för centrifugeringshastigheter och -tider, inkubationstemperatur och varaktighet, pollenmängdsdrivna reagensvolymer och till och med supernatantavlägsnande metod (dekantering vs pipettering) kan dock behöva optimeras experimentellt enligt forskningsmål och i viss utsträckning de typer av pollen som sannolikt kommer att påträffas48. Faktum är att acetolys kan ta bort viktiga diagnostiska tecken hos pollen från vissa taxa som Malvaceae och Orchidaceae38. Därför är inte allt pollen mottagligt för standardmetoder för acetolys. Som nämnts ovan optimerades dessa metoder i denna studie i syfte att identifiera dominerande växttaxonkällor för pollen som samlats in av grödbestämande honungsbin. Detaljer som ska övervägas om exakt kvantifiering av pollenkorn är en del av studien har inte tagits upp i detta dokument.
Användningen av lösningsmedel och syror kräver noggrann planering, korrekt personlig skyddsutrustning (PPE) och ansvarsfull avfallshantering (figur 6). Det är viktigt att forskare bestämmer rätt sätt att lagra reagenser och bortskaffa avfall innan de påbörjar någon del av acetolys. I detta laboratorium används butylhandskar under någon del av processen som involverar svavelsyra och till och med isättika eftersom de har mycket bättre nedbrytnings- och permeationsvärden för båda syrorna än nitrilhandskar, samtidigt som de inte äventyrar fingerfärdighet49. Det vore klokt att konsultera respektive institutions säkerhetsriktlinjer för rekommendationer om lämpliga handskar och annan personlig skyddsutrustning49. Tillsats av isättika före acetolyssteget hjälper till att avlägsna eventuell restfuktighet i provet och förbereder det för den viktiga acetolysreaktionen. Isättika-svavelsyrablandningen i acetolyssteget kan reagera våldsamt med vatten, varför det är viktigt att alla glasvaror och förnödenheter är helt torra och att all fukt avlägsnas från provet före acetolys. Tillsatsen av isättika efter acetolys späds ut och neutraliserar acetolysblandningen.
I synnerhet etanol och isättika kan lösa upp bläcket på mikrocentrifugrörsetiketter, om dessa reagenser droppar på utsidan av röret, även med lösningsmedelsbeständiga pennor. Kontrollera röretiketterna ofta under hela processen för att vara säker på att de fortfarande är läsbara. Om det är logistiskt möjligt kan du överväga att använda LaserJet-tryckta etiketter som ett skydd mot denna möjlighet. Det sätt på vilket supernatanter dekanteras kommer att påverka om reagenser dribblar ner utsidan av mikrocentrifugrören. Det är viktigt att dekantera supernatanten med en säker, slät hand, som kommer med övning. Försiktighet bör iakttas för att undvika förlust av pollenprover från centrifugröret under dekantering. Dekantering för snabbt riskerar att förlora en del eller hela pollenresten; Dekantering för långsamt kan resultera i att supernatanten rinner ner i röret. Även om en inkubationstemperatur på 100 °C vanligtvis rekommenderas, kan pollen lätt bli "överkokt" vid den temperaturen i de mängder som används i denna studie (0,25 g), särskilt om det inkuberas under något längre varaktigheter29. Faktum är att även vid 80 ° C kan pollenkorn brista eller på annat sätt skadas om de lämnas i acetolysblandningen för länge. Inkubationstemperatur och inkubationstid skall bestämmas noggrant för att undvika att pollenkornen i provet förstörs.
Färgning av pollen ökar definitionen och kontrasten av exine-funktionerna, vilket gör det lättare att fotografera och identifiera (figur 7). Fem droppar (från en plastöverföringspipett) av 1% Safranin O färgade effektivt 0,25 g pollen. Men olika pollen fläckar annorlunda. Om pollenkorn färgas för lätt eller för tungt kan identifiering vara svår. När så är möjligt bör den volym fläcklösning som behövs för att på lämpligt sätt fläcka de pollenarter som förväntas finnas i studien valideras innan bearbetningen av försöksproverna påbörjas. Icke desto mindre, om ett av de experimentella proverna inte är ordentligt färgat, kan det korrigeras. För att lätta ett pollenprov som färgas för kraftigt, skölj provet med vatten och sedan etanol. Om pollen inte är färgad tillräckligt bra för att se särdrag kan några ytterligare droppar fläck tillsättas. Fläcken av dessa prover bör kontrolleras innan glycerin tillsätts. På samma sätt kan vissa försök och fel behövas för att bestämma den ideala volymen glycerin för pollenresterna. Femton droppar glycerin skyddade på lämpligt sätt proverna i denna studie från att torka ut, samtidigt som pollenresterna späddes ut till en koncentration som är idealisk för nedströms identifiering via ljusmikroskopi. Andra mängder pollenrester kan kräva mer eller mindre glycerin för att förhindra uttorkning och underlätta montering.
Författarna har inget att avslöja.
Vi tackar Dr. Gretchen Jones (USDA-ARS, APMRU, College Station, TX) för att ha hjälpt till med färgsortering och acetolysanalys. Denna forskning stöddes av forskningsmedel som gavs till R.R.S. av Oregon State Beekeepers Association.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
#8 hardware cloth | 2.7 mm aperture | ||
10 mL graduated cylinder | |||
1000 uL micropipette tips | |||
1250 mL filter micropipette tips | |||
15 x 75 mm glass slides | Thickness: 0.93 mm - 1.05 mm | ||
2 mL microcentrifuge tubes | |||
250 mL graduated Borosilicate glass beakers (x3) | VWR | 10754-952 | |
50 mL graduated Borosilicate glass beakers (x6) | VWR | 10754-946 | |
95% EtOH | Pharmco AAPER | 111000200DM55 | ACS/USP/Kosher grade |
Butyl vinyl gloves | |||
Centrifuge | 1060 x g maximum speed; horizontal swing preferred | ||
Chemical safety goggles | |||
Color guide | Pantone | SKU: GP1601A | Solid coated |
Coverslip of 1 or 1.5 | Thickness: 0.13 mm - 0.19 mm | ||
Distilled water | |||
Forceps | |||
Fume hood | |||
Glacial acetic acid | BDH Chemicals | BDH3092 | ACS grade |
Glass funnel | |||
Glycerin | Humco | 103196001_1 | USP grade, 99.5%, anhydrous |
Hazardous waste containers | |||
Hive tool | |||
Hot block | Must reach 80 degree C | ||
Lab coat with long sleeves | |||
Latex or polyurethane foam | |||
Microscope | |||
Nailpolish, clear | |||
Nitrile gloves | |||
P1000 pipette | VWR | ||
Petri dish | |||
Plastic spoon | |||
Safranin | Ward's Science | 470302-322 | Lab grade |
Smoker | For pollen trap installation | ||
Sodium bicarbonate | EMD Millipore | SX0320 | ACS grade, powder |
Squirt bottles (x2) | |||
Sulfuric acid | EMD Millipore | SX1244 | ACS grade |
Sundance Bottom Mount Pollen Trap | Betterbee Beekeeping Supply | PTRAPB | |
Tape | |||
Wooden stir sticks | |||
Wooden tooth picks |
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved