Abstract
Bioengineering
Traditionele methoden om nucleïnezuren te detecteren en te kwantificeren zijn afhankelijk van polymerasekettingreactie (PCR) en vereisen het gebruik van dure thermocyclers met geïntegreerde fluorescentiedetectie van amplicons. Isotherme nucleïnezuurversterkingstechnologieën elimineren de noodzaak van thermische cycli; fluorescentiegebaseerde detectie van producten is echter nog steeds vereist voor realtime, kwantitatieve resultaten. Verschillende draagbare isotherme kachels met geïntegreerde fluorescentiedetectie zijn nu in de handel verkrijgbaar; de kosten van deze apparaten blijven echter een belangrijke belemmering voor wijdverbreide acceptatie in omgevingen met beperkte middelen. Hier wordt een protocol beschreven voor het ontwerp en de assemblage van een modulaire, goedkope fluorimeter gemaakt van kant-en-klare componenten. De fluorimeter is ingesloten in een compacte 3D-geprinte behuizing en is ontworpen om bovenop een in de handel verkrijgbaar warmteblok met een PCR-buis te worden geplaatst. De hier beschreven fluorimeter is geoptimaliseerd om fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) kleurstof te detecteren, maar het systeem kan worden aangepast voor gebruik met kleurstoffen die vaak worden gebruikt als verslaggevers in realtime nucleïnezuurversterkingsreacties. De klinische toepasbaarheid van het systeem wordt aangetoond door real-time nucleïnezuurdetectie uit te voeren met twee isotherme versterkingstechnologieën: recombinasepolymeraseversterking (RPA) voor detectie van positief controle-DNA in een commerciële kit en omgekeerde transcriptielusgemedieerde isotherme versterking (RT-LAMP) voor detectie van klinisch betekenisvolle niveaus van SARS-CoV-2 RNA.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved