A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине. Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).
Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.
Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции....
1. Производство переходных клеточных линий
Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное д?.......
Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата опр.......
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate | Corning | MT25053CI | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | Prepare 1% in 1x PBS |
6 Well Culture Plate | VWR | 10861-554 | |
Aluminum Foil | Fisher Scientific | 01-213-101 | |
Anti-mCherry antibody | Abcam | Ab183628 | |
Anti-PML antibody | Santa Cruz | sc966 | |
Anti-SUMO1 antibody | Abcam | Ab32058 | |
Anti-SUMO2/3 antibody | Cytoskeleton | Asm23 | |
Blocking Reagent | Roche | 11096176001 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP9706100 | |
BTX Tube micro 1.5ML | VWR | 89511-258 | |
Circle Cover Slips | Thermo Scientific | 3350 | |
Confocal microscope | Nikon | MQS31000 | |
DAPI | Fisher Scientific | D1306 | |
Dimethyl Sulphoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10017CV | |
EMCCD Camera | iXon Life | 897 | |
Ethanol | Fisher Scientific | 4355221 | |
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions | Gibco | A4766801 | |
Formamide, Deionized | MilliporeSigma | 46-101-00ML | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A28181 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A32733 | |
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps | Fisher Scientific | 12-000-122 | |
Laser merge module | Nikon | NIIMHF47180 | |
Leibovitz's L-15 Medium | Gibco | 21083027 | |
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Invitrogen | 11668027 | |
Figure plotting software, MATLAB | The MathWorks | ||
Microscope Slide Box | Fisher Scientific | 34487 | |
Nail Polish | Fisher Scientific | 50-949-071 | |
Imaging software, NIS-Elements | Nikon | ||
Opti-MEM Reduced Serum Media | Gibco | 51985091 | |
Parafilm | Bemis | 13-374-12 | |
PBS 10x, pH 7.4 | Fisher Scientific | 70-011-044 | |
Penicillin-Streptomycin Solution,100X | Gibco | 15140122 | |
Piezo Z-Drive | Physik Instrumente (PI) | 91985 | |
Pipet Tips | VWR | 10017 | |
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-037-246 | |
Poly-D-Lysine solution | Sigma-Aldrich | A-003-E | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | BP922I-500 | |
Spinning disk | Yokogawa | CSU-X1 | |
Square Cover Slips | Thermo Scientific | 3305 | |
TBS 10x solution | Fisher Scientific | BP2471500 | |
TelC-Alexa488 | PNA Bio | F1004 | |
TMP | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
TNH | Synthesized by Chenoweth lab | Available upon request | |
Tris Solution | Fisher Scientific | 92-901-00ML | |
Triton X-100 10% Solution | MilliporeSigma | 64-846-350ML | Prepare 0.5% in 1x PBS |
U2Os cell line | From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore) | HTB-96 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | NC9524612 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved