Химические белковые конденсаты, индуцированные димеризацией, на теломерах

Резюме

Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине.  Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Аннотация

Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.

Введение

Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках^1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина^3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома^4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции....

протокол

1. Производство переходных клеточных линий

1. Культивируемые акцепторные клетки U2OS на стеклянные крышки диаметром 22 х 22 мм (для живой визуализации) или круглые покровные пластинки диаметром 12 мм (для ПЧ или FISH), покрытые поли-D-листином в 6-й колодце со средой роста (10% фетальная бычья сыворотка и 1% раствор пенициллин-стрептомицин в ДМЭМ) до тех пор, пока они не достигнут 60-70% конфюлюзии.
2. Перед трансфекцией заменить питательную среду трансфекцией 1 мл (питательную среду без раствора пенициллина-стрептомицина).
3. Для каждой трансфекционной скважины добавляют 4 мкл трансфекционного реагента к 150 мкл восстановленной с....

Результаты

Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное д?.......

Обсуждение

Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата опр.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium Bicarbonate	Corning	MT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free	Thermo Scientific	28906	Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture Plate	VWR	10861-554
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-101
Anti-mCherry antibody	Abcam	Ab183628
Anti-PML antibody	Santa Cruz	sc966
Anti-SUMO1 antibody	Abcam	Ab32058
Anti-SUMO2/3 antibody	Cytoskeleton	Asm23
Blocking Reagent	Roche	11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9706100
BTX Tube micro 1.5ML	VWR	89511-258
Circle Cover Slips	Thermo Scientific	3350
Confocal microscope	Nikon	MQS31000
DAPI	Fisher Scientific	D1306
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10017CV
EMCCD Camera	iXon Life	897
Ethanol	Fisher Scientific	4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved Regions	Gibco	A4766801
Formamide, Deionized	MilliporeSigma	46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/Forceps	Fisher Scientific	12-000-122
Laser merge module	Nikon	NIIMHF47180
Leibovitz's L-15 Medium	Gibco	21083027
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent	Invitrogen	11668027
Figure plotting software, MATLAB	The MathWorks
Microscope Slide Box	Fisher Scientific	34487
Nail Polish	Fisher Scientific	50-949-071
Imaging software, NIS-Elements	Nikon
Opti-MEM Reduced Serum Media	Gibco	51985091
Parafilm	Bemis	13-374-12
PBS 10x, pH 7.4	Fisher Scientific	70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100X	Gibco	15140122
Piezo Z-Drive	Physik Instrumente (PI)	91985
Pipet Tips	VWR	10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope Slides	Fisher Scientific	22-037-246
Poly-D-Lysine solution	Sigma-Aldrich	A-003-E
Sodium Azide	Fisher Scientific	BP922I-500
Spinning disk	Yokogawa	CSU-X1
Square Cover Slips	Thermo Scientific	3305
TBS 10x solution	Fisher Scientific	BP2471500
TelC-Alexa488	PNA Bio	F1004
TMP	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
TNH	Synthesized by Chenoweth lab		Available upon request
Tris Solution	Fisher Scientific	92-901-00ML
Triton X-100 10% Solution	MilliporeSigma	64-846-350ML	Prepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell line	From E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)	HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium	Vector Laboratories	NC9524612