Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Этот протокол иллюстрирует химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на хроматине.  Показано образование ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах с химическими димеризаторами. Рост, растворение, локализацию и состав капель контролируются с помощью визуализации живых клеток, иммунофлуоресценции (IF) и флуоресцентной гибридизации in situ (FISH).

Abstract

Хроматин-ассоциированные конденсаты участвуют во многих ядерных процессах, но лежащие в их основе механизмы остаются неуловимыми. Этот протокол описывает химически индуцированную систему димеризации белка для создания конденсатов на теломерах. Химический димеризатор состоит из двух связанных лигандов, каждый из которых может связываться с белком: галолиганд с гало-ферментом и триметоприм (TMP) с дигидрофолатредуктазой E. coli (eDHFR), соответственно. Слияние фермента Halo с теломерным белком прикрепляет димеризаторы к теломерам посредством ковалентного связывания Halo лиганд-фермент. Связывание TMP с eDHFR рекрутирует eDHFR-плавленую фазу, разделяющую белки на теломеры, и индуцирует образование конденсата. Поскольку взаимодействие TMP-eDHFR является нековалентным, конденсацию можно обратить вспять, используя избыточный свободный TMP, чтобы конкурировать с димеризатором за связывание eDHFR. Приведен пример индуцирования образования ядерного тела промиелоцитарного лейкоза (ПМЛ) на теломерах и определения роста, растворения, локализации и состава конденсата. Этот метод может быть легко адаптирован для индуцирования конденсатов в других геномных местах путем слияния Halo с белком, который непосредственно связывается с местным хроматином или с dCas9, который нацелен на геномный локус с направляющей РНК. Предлагая временное разрешение, необходимое для визуализации одиночных клеток в реальном времени, сохраняя при этом разделение фаз в популяции клеток для биохимических анализов, этот метод подходит для исследования как образования, так и функции конденсатов, связанных с хроматином.

Introduction

Многие белки и нуклеиновые кислоты подвергаются разделению жидкой фазы (LLPS) и самособираются в биомолекулярные конденсаты для организации биохимии в клетках1,2. LLPS хроматинсвязывающих белков приводит к образованию конденсатов, которые связаны со специфическими геномными локусами и участвуют в различных функциях местного хроматина3. Например, ТОО белка HP1 лежит в основе формирования гетерохроматиновых доменов для организации генома4,5,ТООО факторов транскрипции формирует транскрипционные центры для регулирования транскрипции....

Protocol

1. Производство переходных клеточных линий

  1. Культивируемые акцепторные клетки U2OS на стеклянные крышки диаметром 22 х 22 мм (для живой визуализации) или круглые покровные пластинки диаметром 12 мм (для ПЧ или FISH), покрытые поли-D-листином в 6-й колодце со средой роста (10% фетальна?.......

Representative Results

Репрезентативные изображения теломерной локализации SUMO, идентифицированные теломерной ДНК FISH и белка SUMO IF, показаны на рисунке 2. Клетки с набором SIM-карты обогащали SUMO1 и SUMO 2/3 на теломерах по сравнению с клетками с набором мутантов SIM. Это указывает на то, что вызванное д?.......

Discussion

Этот протокол продемонстрировал образование и растворение конденсатов на теломерах с помощью системы химической димеризации. Кинетика разделения фаз и кластеризация теломер, вызванная слиянием капель, контролируются с помощью живой визуализации. Локализацию и состав конденсата опр.......

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения США (1K22CA23763201 до H.Z., GM118510 до D.M.C.) и Фондом Чарльза Э. Кауфмана для H.Z. Авторы хотели бы поблагодарить Джейсона Тонса за корректуру рукописи.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin, 0.1% EDTA in HBSS w/o Calcium, Magnesium and Sodium BicarbonateCorningMT25053CI
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-freeThermo Scientific28906Prepare 1% in 1x PBS
6 Well Culture PlateVWR10861-554
Aluminum FoilFisher Scientific01-213-101
Anti-mCherry antibodyAbcamAb183628
Anti-PML antibodySanta Cruzsc966
Anti-SUMO1 antibodyAbcamAb32058
Anti-SUMO2/3 antibodyCytoskeletonAsm23
Blocking ReagentRoche11096176001
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9706100
BTX Tube micro 1.5ML VWR89511-258
Circle Cover SlipsThermo Scientific3350
Confocal microscope NikonMQS31000
DAPIFisher ScientificD1306
Dimethyl Sulphoxide Sigma-Aldrich472301
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium PyruvateCorningMT10017CV
EMCCD CameraiXon Life 897
EthanolFisher Scientific4355221
Fetal Bovine Serum, Qualified, USDA-approved RegionsGibcoA4766801
Formamide, DeionizedMilliporeSigma46-101-00ML
Goat anti-Mouse IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA28181
Goat anti-Rabbit IgG (H+L), Recombinant Secondary Antibody, Alexa Fluor 647InvitrogenA32733
High Precision Straight Tapered Ultra Fine Point Tweezers/ForcepsFisher Scientific12-000-122
Laser merge module NikonNIIMHF47180
Leibovitz's L-15 MediumGibco21083027
Lipofectamine 2000 Transfection ReagentInvitrogen11668027
Figure plotting software, MATLABThe MathWorks
Microscope Slide BoxFisher Scientific34487
Nail PolishFisher Scientific50-949-071
Imaging software, NIS-Elements Nikon
Opti-MEM Reduced Serum MediaGibco51985091
ParafilmBemis13-374-12
PBS 10x, pH 7.4Fisher Scientific70-011-044
Penicillin-Streptomycin Solution,100XGibco15140122
Piezo Z-Drive Physik Instrumente (PI)91985
Pipet TipsVWR10017
Plain and Frosted Clipped Corner Microscope SlidesFisher Scientific22-037-246
Poly-D-Lysine solutionSigma-AldrichA-003-E
Sodium AzideFisher ScientificBP922I-500
Spinning diskYokogawaCSU-X1
Square Cover SlipsThermo Scientific3305
TBS 10x solutionFisher ScientificBP2471500
TelC-Alexa488PNA BioF1004
TMPSynthesized by Chenoweth labAvailable upon request
TNHSynthesized by Chenoweth labAvailable upon request
Tris SolutionFisher Scientific92-901-00ML
Triton X-100 10% SolutionMilliporeSigma64-846-350MLPrepare 0.5% in 1x PBS
U2Os cell lineFrom E.V. Makayev lab (Nanyang Technological University, Singapore)HTB-96
VECTASHIELD Antifade Mounting MediumVector LaboratoriesNC9524612

References

  1. Shin, Y., Brangwynne, C. P. Liquid phase condensation in cell physiology and disease. Science. 357 (6357), (2017).
  2. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

170

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved